棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立

贾章志 徐晓阳 赵秀峰

摘 要：梯度浓度棕榈酸（Palmitate，PA）孵育的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立。研究方法：将分化5天小鼠骨骼肌肌母细胞的肌管用不同浓度的PA培养液孵育16h后，寻找孵育结束后培养液中葡萄糖剩余量比对照组显著高，胰岛素刺激也不能使糖明显吸收，肌管内有明显脂质积累的浓度作为C2C12肌管胰岛素抵抗建立的合适浓度。研究结果：分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕榈酸溶液孵育16h，会致胰岛素抵抗的发生。

关键词：C2C12 棕榈酸 胰岛素抵抗

中图分类号：G80-32 文献标识码：A 文章编号：2095-2813（2018）05（c）-0001-02

胰岛素抵抗（ Insulin Resistance，IR）是指一定量的胰岛素与受体结合后生物效应低于正常，表现为外周组织尤其是脂肪、肌肉组织对葡萄糖的摄取障碍及肝葡萄糖输出增多[1]。国家卫生部统计显示我国新增糖尿病患者绝大多数为2型糖尿病患者。被认为是2型糖尿病的发病基础的IR，是当今影响人身体健康最主要的代谢性疾病。随着社会发展、饮食习惯的改变，肥胖人群不断壮大，肥胖和胰岛素抵抗的关系也成为当今研究热点。大量研究表明，血液中高游离脂肪酸与胰岛素抵抗的发生关系十分密切。高游离脂肪酸较为敏感的影响着胰岛素抵抗现象，是其发生的主要原因之一[2]。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料和基本培养方法

小鼠骨骼肌肌母细胞株（C2C12细胞）购买于由南方医科大学。细胞复苏：将细胞从液氮中取出后迅速放入38℃～40℃的水中，快速摇晃使其解冻。解冻后用酒精对冻存管表面消毒，移入超净工作台，将含有细胞的冻存液吸出移入到60mm培养皿中，加入增殖培养液后混匀，静置5min后转移到恒温培养箱（37℃，5%CO2+95%空气，饱和湿度）。4h后更换培养液，此后每隔48h换液一次，及时观察细胞生长状态。细胞传代：细胞传代的标准是长到培养皿80%面积。抽离废弃营养液，PBS冲洗，滴入适量胰酶，覆盖皿底，放置培养箱消化2～3min。显微镜下观察，细胞形状由不规则变为圆形，间隙变宽时，加入含血清的培养液终止消化，轻敲皿底，并适度吹打。显微镜下观察，细胞脱离皿底时，将细胞悬液吸入离心管，离心，弃上清，向离心管中加入培养液，吹打混匀，然后以1∶3的比例种入新的60mm培养皿中，静置5min后，转移到培养箱培养。细胞冻存：取状态好的细胞，经PBS清洗，胰酶消化，离心后，弃上清，向离心管中加入约1mL细胞冻存液，混匀，转移到冻存管中，封口膜密封冻存管，经4℃（30min）、-20℃（2h）、-80℃（过夜）的顺序处理细胞，最后转移至液氮中长期保存。细胞分化：细胞分化的标准是长到培养皿95%面积，换分化培养液。2天换一次培养液，换分化培养液后开始计算分化天数。

1.2 实验方案

以小鼠骨骼肌肌母细胞（C2C12）为研究对象，将分化5天的肌管换1%BSA的低糖无血清培养液12h后分为对照组、PA0.25组、PA0.5组、PA0.75组、PA1.0组、胰岛素组、PA0.25+胰岛素组、PA0.5+胰岛素组、PA0.75+胰岛素组、PA1.0+胰岛素组，对照组和胰岛素组换2%BSA无酚红高糖DMEM，其他组换PA浓度与组名相对应，分别为0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L培养液，胰岛素组、PA0.25+胰岛素组、PA0.5+胰岛素组、PA0.75+胰島素组、PA1.0+胰岛素组在孵育结束前30min加入100nmol/L的胰岛素。16h后检测细胞培养液中葡萄糖剩余量，MTT法检测PA浓度对肌管活性的影响，寻找PA孵育的安全剂量，油红O染色确定肌管内的脂质积累。

1.3 油红O染色法检测肌管内脂肪含量

油红O属于偶氮染料，具有亲脂性，容易对脂类染色，临床上常用来对组织器官内的脂肪进行染色。本研究利用油红O染色判定经PA孵育16h的肌管是否有脂质的积累。

1.4 C2C12肌管MTT增殖毒性测定

MTT是一种可以接受氢原子的染料，加入细胞的培养基中，被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原成不溶于水的深紫色结晶甲瓒，死细胞则不可以进行这个反应。DMSO可以溶解细胞中的甲瓒，酶标仪在570nm波长附近可测定溶液中甲瓒浓度，通过测定就可以判断活细胞的数量和代谢能力。吸光值大小可以反应存活细胞的数量和其活性。

1.5 C2C12肌管培养液葡萄糖剩余量测定

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测上清液中剩余葡萄糖浓度，酶标仪测得OD值后通过公式计算得出，普利莱基因技术提供试剂盒。

1.6 数据统计处理

本研究利用SPSS 19.0软件进行数据处理，用平均值±标准差（s）的方式表示数据。各组数据间差异的显著性用单因素方差分析检验，P<0.05即具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。

2 研究结果

2.1 PA孵育后C2C12肌管培养液糖剩余量和MTT的变化

经过16h的孵育，0.5、0.75、1.0mmol/L的PA培养液处理的肌管与没有经过PA处理的对照组相比，培养液中剩余葡萄糖量有显著升高（P<0.01）。PA+胰岛素组的葡萄糖剩余量数据显示：胰岛素组和PA0.25+胰岛素组肌管由于胰岛素的作用，葡萄糖剩余量与不加胰岛素的对照组和PA0.25组相比明显减少（P<0.01）。PA0.5+胰岛素组与PA0.5组相比葡萄糖剩余量没有显著性差异（P>0.05）。PA0.75组和PA1.0组的肌管经过孵育后细胞活性减弱，与对照组对比具有显著性差异（P<0.01），说明0.75mmol/L、1.0mmol/L的PA培养液孵育16h影响肌管活力。0.5mmol/L的PA培养液对肌管活性没有显著性影响（P>0.05）。

2.2 PA孵育后C2C12肌管脂质积累变化

对比发现：经过0.5mmol/LPA培养液孵育16h的C2C12肌管内脂质的积累有所增加，说明了PA孵育可以引起肌管内脂质的积累，从而影响肌管的糖代谢作用。

3 分析与讨论

本研究选取C2C12细胞为实验对象，孵育16h，筛选适当孵育浓度，在复制胰岛素抵抗模型基础上进一步研究收缩对胰岛素抵抗的影响。通过梯度浓度PA（0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L）培养液和胰岛素孵育分化5天的C2C12肌管16h（胰岛素在收样前30min加入一部分PA孵育的肌管培养液中），收样后检测培养液葡萄糖剩余量，计算出C2C12肌管对葡萄糖的摄取量，以此来鉴定胰岛素抵抗模型是否建立成功。0.7、1.0mmol/L孵育肌管16h，虽然葡萄糖剩余量增加，但MTT结果显示此浓度的PA孵育对肌管活性会造成影响。浓度为0.5mmol/L的PA培养液孵育肌管16h后，培养液上清的葡萄糖剩余量明显高于对照，MTT结果相对对照组没有显著性变化，细胞活性不受影响。加入胰岛素孵育组与单纯PA组相比葡萄糖剩余量没有显著性变化，表明胰岛素对0.5mmol/L的PA培养液孵育16h后的肌管作用减弱，肌管对胰岛素的敏感性降低，产生了胰岛素耐受，胰岛素抵抗形成。通过对比我们也发现，经过油红O染色后，0.5mmol/L PA培养液孵育过的肌管内红色脂质颗粒有所增加，脂质积累增加，说明PA孵育可以引起肌管脂质积累，从而影响肌管的糖代谢作用。

4 结语

分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕榈酸溶液孵育16h，会致胰岛素抵抗的发生。

参考文献

[1] 陈梦云，江国荣.胰岛素抵抗细胞模型研究进展[J].安徽医药，2012（2）：141-143.

[2] 刘滨，方爱英.2型糖尿病患者胰岛素抵抗与血清游离脂肪酸浓度的关系[J].中国现代药物应用，2013（14）：83-84.