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棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立

2018-06-11贾章志徐晓阳赵秀峰

当代体育科技 2018年15期
关键词:胰岛素抵抗

贾章志 徐晓阳 赵秀峰

摘 要:梯度浓度棕榈酸(Palmitate,PA)孵育的C2C12肌管胰岛素抵抗模型的建立。研究方法:将分化5天小鼠骨骼肌肌母细胞的肌管用不同浓度的PA培养液孵育16h后,寻找孵育结束后培养液中葡萄糖剩余量比对照组显著高,胰岛素刺激也不能使糖明显吸收,肌管内有明显脂质积累的浓度作为C2C12肌管胰岛素抵抗建立的合适浓度。研究结果:分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕榈酸溶液孵育16h,会致胰岛素抵抗的发生。

关键词:C2C12 棕榈酸 胰岛素抵抗

中图分类号:G80-32 文献标识码:A 文章编号:2095-2813(2018)05(c)-0001-02

胰岛素抵抗( Insulin Resistance,IR)是指一定量的胰岛素与受体结合后生物效应低于正常,表现为外周组织尤其是脂肪、肌肉组织对葡萄糖的摄取障碍及肝葡萄糖输出增多[1]。国家卫生部统计显示我国新增糖尿病患者绝大多数为2型糖尿病患者。被认为是2型糖尿病的发病基础的IR,是当今影响人身体健康最主要的代谢性疾病。随着社会发展、饮食习惯的改变,肥胖人群不断壮大,肥胖和胰岛素抵抗的关系也成为当今研究热点。大量研究表明,血液中高游离脂肪酸与胰岛素抵抗的发生关系十分密切。高游离脂肪酸较为敏感的影响着胰岛素抵抗现象,是其发生的主要原因之一[2]。

1 研究材料与方法

1.1 研究材料和基本培养方法

小鼠骨骼肌肌母细胞株(C2C12细胞)购买于由南方医科大学。细胞复苏:将细胞从液氮中取出后迅速放入38℃~40℃的水中,快速摇晃使其解冻。解冻后用酒精对冻存管表面消毒,移入超净工作台,将含有细胞的冻存液吸出移入到60mm培养皿中,加入增殖培养液后混匀,静置5min后转移到恒温培养箱(37℃,5%CO2+95%空气,饱和湿度)。4h后更换培养液,此后每隔48h换液一次,及时观察细胞生长状态。细胞传代:细胞传代的标准是长到培养皿80%面积。抽离废弃营养液,PBS冲洗,滴入适量胰酶,覆盖皿底,放置培养箱消化2~3min。显微镜下观察,细胞形状由不规则变为圆形,间隙变宽时,加入含血清的培养液终止消化,轻敲皿底,并适度吹打。显微镜下观察,细胞脱离皿底时,将细胞悬液吸入离心管,离心,弃上清,向离心管中加入培养液,吹打混匀,然后以1∶3的比例种入新的60mm培养皿中,静置5min后,转移到培养箱培养。细胞冻存:取状态好的细胞,经PBS清洗,胰酶消化,离心后,弃上清,向离心管中加入约1mL细胞冻存液,混匀,转移到冻存管中,封口膜密封冻存管,经4℃(30min)、-20℃(2h)、-80℃(过夜)的顺序处理细胞,最后转移至液氮中长期保存。细胞分化:细胞分化的标准是长到培养皿95%面积,换分化培养液。2天换一次培养液,换分化培养液后开始计算分化天数。

1.2 实验方案

以小鼠骨骼肌肌母细胞(C2C12)为研究对象,将分化5天的肌管换1%BSA的低糖无血清培养液12h后分为对照组、PA0.25组、PA0.5组、PA0.75组、PA1.0组、胰岛素组、PA0.25+胰岛素组、PA0.5+胰岛素组、PA0.75+胰岛素组、PA1.0+胰岛素组,对照组和胰岛素组换2%BSA无酚红高糖DMEM,其他组换PA浓度与组名相对应,分别为0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L培养液,胰岛素组、PA0.25+胰岛素组、PA0.5+胰岛素组、PA0.75+胰島素组、PA1.0+胰岛素组在孵育结束前30min加入100nmol/L的胰岛素。16h后检测细胞培养液中葡萄糖剩余量,MTT法检测PA浓度对肌管活性的影响,寻找PA孵育的安全剂量,油红O染色确定肌管内的脂质积累。

1.3 油红O染色法检测肌管内脂肪含量

油红O属于偶氮染料,具有亲脂性,容易对脂类染色,临床上常用来对组织器官内的脂肪进行染色。本研究利用油红O染色判定经PA孵育16h的肌管是否有脂质的积累。

1.4 C2C12肌管MTT增殖毒性测定

MTT是一种可以接受氢原子的染料,加入细胞的培养基中,被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原成不溶于水的深紫色结晶甲瓒,死细胞则不可以进行这个反应。DMSO可以溶解细胞中的甲瓒,酶标仪在570nm波长附近可测定溶液中甲瓒浓度,通过测定就可以判断活细胞的数量和代谢能力。吸光值大小可以反应存活细胞的数量和其活性。

1.5 C2C12肌管培养液葡萄糖剩余量测定

葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测上清液中剩余葡萄糖浓度,酶标仪测得OD值后通过公式计算得出,普利莱基因技术提供试剂盒。

1.6 数据统计处理

本研究利用SPSS 19.0软件进行数据处理,用平均值±标准差(s)的方式表示数据。各组数据间差异的显著性用单因素方差分析检验,P<0.05即具有显著性差异,P<0.01具有极显著性差异。

2 研究结果

2.1 PA孵育后C2C12肌管培养液糖剩余量和MTT的变化

经过16h的孵育,0.5、0.75、1.0mmol/L的PA培养液处理的肌管与没有经过PA处理的对照组相比,培养液中剩余葡萄糖量有显著升高(P<0.01)。PA+胰岛素组的葡萄糖剩余量数据显示:胰岛素组和PA0.25+胰岛素组肌管由于胰岛素的作用,葡萄糖剩余量与不加胰岛素的对照组和PA0.25组相比明显减少(P<0.01)。PA0.5+胰岛素组与PA0.5组相比葡萄糖剩余量没有显著性差异(P>0.05)。PA0.75组和PA1.0组的肌管经过孵育后细胞活性减弱,与对照组对比具有显著性差异(P<0.01),说明0.75mmol/L、1.0mmol/L的PA培养液孵育16h影响肌管活力。0.5mmol/L的PA培养液对肌管活性没有显著性影响(P>0.05)。

2.2 PA孵育后C2C12肌管脂质积累变化

对比发现:经过0.5mmol/LPA培养液孵育16h的C2C12肌管内脂质的积累有所增加,说明了PA孵育可以引起肌管内脂质的积累,从而影响肌管的糖代谢作用。

3 分析与讨论

本研究选取C2C12细胞为实验对象,孵育16h,筛选适当孵育浓度,在复制胰岛素抵抗模型基础上进一步研究收缩对胰岛素抵抗的影响。通过梯度浓度PA(0.25、0.5、0.75、1.0mmol/L)培养液和胰岛素孵育分化5天的C2C12肌管16h(胰岛素在收样前30min加入一部分PA孵育的肌管培养液中),收样后检测培养液葡萄糖剩余量,计算出C2C12肌管对葡萄糖的摄取量,以此来鉴定胰岛素抵抗模型是否建立成功。0.7、1.0mmol/L孵育肌管16h,虽然葡萄糖剩余量增加,但MTT结果显示此浓度的PA孵育对肌管活性会造成影响。浓度为0.5mmol/L的PA培养液孵育肌管16h后,培养液上清的葡萄糖剩余量明显高于对照,MTT结果相对对照组没有显著性变化,细胞活性不受影响。加入胰岛素孵育组与单纯PA组相比葡萄糖剩余量没有显著性变化,表明胰岛素对0.5mmol/L的PA培养液孵育16h后的肌管作用减弱,肌管对胰岛素的敏感性降低,产生了胰岛素耐受,胰岛素抵抗形成。通过对比我们也发现,经过油红O染色后,0.5mmol/L PA培养液孵育过的肌管内红色脂质颗粒有所增加,脂质积累增加,说明PA孵育可以引起肌管脂质积累,从而影响肌管的糖代谢作用。

4 结语

分化5天的C2C12肌管利用0.5mmol/L的棕榈酸溶液孵育16h,会致胰岛素抵抗的发生。

参考文献

[1] 陈梦云,江国荣.胰岛素抵抗细胞模型研究进展[J].安徽医药,2012(2):141-143.

[2] 刘滨,方爱英.2型糖尿病患者胰岛素抵抗与血清游离脂肪酸浓度的关系[J].中国现代药物应用,2013(14):83-84.

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