无溶剂体系中毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化合成肉桂醇酯

徐晓敏，黄奎，韩双艳

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

肉桂醇具有类似风信子的令人愉快的香气，其脂肪酸酯也是非常重要的芳香类化合物，广泛应用于食品，日化以及医药行业[1]。目前，市面上的肉桂醇酯绝大部分是由化学方法合成[2～4]。化学方法在生产香精香料的过程中，常伴随着多种副产物的生成，大大影响了产物的品质，并且具有反应环境苛刻，对设备要求高，产物分离困难等缺点[5～7]。

国际立法规定，“天然”风味物质只能通过物理过程（从天然产物提取）、酶促或微生物处理来制备[8]。酶法合成香料以其反应条件温和，产物纯度高，立体选择性好以及环境友好等特点，越来越受到人们的关注。为酶促合成香料反应找到适宜的生物催化剂，使该方法能大规模使用[9～13]具有广泛的经济效益。

用于催化反应的脂肪酶主要有游离和固定化两种形式[14～18]，在实际应用的过程中，游离酶存在分离困难，难以回收重复利用等问题，目前应用于肉桂醇酯合成的酶制剂主要为商业化的固定化脂肪酶，Novozyme435[19,20]。但其成本较高，因此发展廉价易得的新酶源显得迫在眉睫。

南极假丝酵母脂肪酶 B(Candida antarcticalipaseB，CALB)是用途最为广泛的脂肪酶之一，具有很高的催化活性，以表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母为全细胞催化剂（Pp-CALB），不但具有固定化酶的优点，而且生产工艺简单[21,22]，能够有效降低生产成本。Han等[23]利用Flo1p絮凝素将米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor mieheilipase，RML)展示在毕赤酵母表面，Huang等[24]用其催化大豆油的醇解反应制备生物柴油，72 h甲酯产率达到83%。Su等[25]利用凝集素将CALB展示在毕赤酵母表面，发现其水解活力要比酿酒酵母展示的CALB高10倍，接近商品酶Novozyme 435，在有机相合成丙酸乙酯和乙酸乙酯，反应9 h底物摩尔转化率达到95%以上。由于毕赤酵母能进行高密度发酵，与酿酒酵母相比，毕赤酵母展示CALB能够有效降低全细胞催化剂的生产成本。目前尚未有用毕赤酵母表面展示CALB全细胞催化剂催化合成肉桂醇酯的相关报道。本研究基于毕赤酵母表面展示技术，用表面展示CALB毕赤酵母全细胞为催化剂在无溶剂体系中催化合成肉桂醇酯，初步探讨了Pp-CALB合成乙酸肉桂酯的最适反应条件及操作稳定性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

毕赤酵母重组菌株 GS115-pPIC9K-CALB-GCW（12+51+61），为本实验室构建及保存[26,27]。其结构示意图如图1所示。

图1 毕赤酵母表面展示脂肪酶CALB结构示意图Fig.1 Structure schematic illustration of Pp-CALB whole-cell biocatalyst

Pp-CALB，指利用毕赤酵母(Pichia pastoris)壁蛋白GCW21，GCW51和GCW61作为锚定蛋白，将南极假丝酵母脂肪酶 B (Candida antarcticalipase B，CALB)展示在毕赤酵母细胞表面的一种全细胞生物催化剂。

1.1.2 培养基

无氨基酸酵母氮源YNB(Yeast nitrogen base)、蛋白胨(PEP)均购自 Difco公司；酵母抽提物(YE)购自Oxford公司；YPD(Yeast extract peptone dextrose medium)、BMGY(Buffered glycerol-complex medium)、BMMY(Buffered methanol-complex medium)等培养基均按Invitrogen公司毕赤酵母表达操作手册配方配制。

1.1.3 试剂

肉桂醇、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、乙酸酐、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、乙酸丁酯均为分析纯，无水乙醇(HPLC级)，以上有机溶剂经分子筛脱水处理。

1.2 实验方法

1.2.1 全细胞催化剂的制备

将毕赤酵母重组菌株 GS115-pPIC9K-CALBGCW（12+51+61）培养于YPD琼脂固体平板上，24 h后接种至YPD液体培养基中，30 ℃、250 r/min培养24 h，以1%的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30 ℃、250 r/min培养24 h，然后在4 ℃、8000 r/min离心10 min得到菌体，转入BMMY培养基中，30 ℃、250 r/min培养5 d，每隔24 h加入1%(V/V)甲醇诱导。然后收集发酵菌体，离心，用pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液洗2次，最后用pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液重悬，通过真空冷冻干燥得到催化剂干粉。

1.2.2 全细胞脂肪酶水解活力的测定

采用吸光度测定脂肪酶活力[28]。检测全细胞催化剂干粉的酶活：用50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.5)配置浓度为2 mmol/L的pNPB作为酶反应底物，其中添加0.5%的Triton-X100。然后向0.5 mL的菌体重悬液中加入0.5 mL浓度为2 mmol/L的底物溶液，45 ℃下反应一定时间，测定OD405值。每个样品均测定3个平行样，用未携带 CALB基因的重组毕赤酵母菌体GS115-pPIC9K-GCW（12+51+61）作空白对照。一个酶活力单位为每分钟水解底物生成 1 μmol对硝基苯酚所需的酶量[29]，测得冻干粉水解酶活为 4032 U/(g·dry cell)。

1.2.3 全细胞催化剂合成肉桂醇酯

10 mL具塞锥形瓶中加入 12 mmol脂肪酸与 6 mmol肉桂醇，加入适量4Å分子筛以去除反应生成的水，放入恒温摇床中预热30 min。加入一定量的全细胞催化剂，于恒温摇床中反应3 h。在不同的反应条件(摇床转速、温度、底物比例和酶加量等)下进行实验。反应结束后离心取反应液上清，-20 ℃保存待测。

1.2.4 反应过程气相色谱分析

采用Agilent7820A气相色谱仪进行反应底物和产物定量分析，取反应液10 μL，用无水乙醇稀释至测定范围，经有机微孔滤膜过滤后进行分析，色谱条件如下：载气为氮气；FID检测器，检测器温度300 ℃，色谱柱HP-5，分流比40:1，柱箱温度160 ℃，维持1 min，以30 ℃/min升温至270 ℃，维持5 min。

1.2.5 酯化率的测定

利用外标法计算肉桂醇含量，反应酯化率由底物肉桂醇的消耗量来衡量。酯化率计算公式：

酯化率=[1-(W2/W1)]×100%

式中，W1，W2分别为酯化反应前后体系中肉桂醇的含量(mmol)。

2 结果与讨论

2.1 酰基供体对Pp-CALB催化合成肉桂醇酯的影响

图2 不同脂肪酸对Pp-CALB催化肉桂醇酯化反应的影响Fig.2 Effect of different aliphatic acids on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

向10 mL反应瓶中加入6 mmol肉桂醇和12 mmol脂肪酸，以及0.05 gPp-CALB，在无溶剂体系中进行肉桂醇酯的合成反应，采用的脂肪酸分别为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸。考察Pp-CALB对脂肪酸的选择性，探讨建立无溶剂反应体系的可行性，在温度50 ℃，摇床转速200 r/min下反应3 h，结果如图2所示。

由图可看出，Pp-CALB对于含有支链的脂肪酸催化活性较低，这可能与CALB的催化结构域大小有关[17]。乙酸和丙酸在无溶剂体系中的酯化率均很低，甲酸、丁酸、戊酸在无溶剂体系中的酯化率分别可达55.42%，63.50%，64.22%，可能是乙酸，丙酸极性较大，易形成亲水性界面，夺取脂肪酶表面的必需水，破坏了蛋白质的三维结构，使部分酶失活[30]。

图3 不同酰基供体对Pp-CALB催化肉桂醇酯化反应的影响Fig.3 Effect of different acyl donors on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

乙酸肉桂酯是一种在工业生产中有较大需求的酯类香料，以乙酸肉桂酯合成为例，比较乙酸、乙酸酐、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、乙酸丁酯几类常用酰基供体的作用效果，结果如图 3所示。由图可看出，以乙酸乙烯酯和乙酸异丙烯酯作为酰基供体时获得的酯化率较高，由于乙酸异丙烯酯成本较高，故以下研究中选择乙酸乙烯酯作为酰基供体。

2.2 摇床转速对Pp-CALB催化肉桂醇转酯反应的影响

图4 摇床转速对Pp-CALB催化肉桂醇酯化反应的影响Fig.4 Effect of agitation speed on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

摇床转速影响着酶催化反应的传质，传热以及底物同酶的接触几率。控制适合的转速既能保证良好的传质传热，又可节约能耗。在无溶剂体系中考察了摇床转速对反应的影响，结果如图4所示。由图可看出，随着摇床转速从40 r/min增加到120 r/min，酯化率逐渐提高，因为无溶剂体系粘度较高，具有一定的传质阻力，提高转速能够有效增加底物与酶接触的概率。当摇床转速再升高时，酯化率无明显提升。故 120 r/min的转速己经可以满足体系反应要求。

2.3 温度对Pp-CALB催化肉桂醇转酯反应的影响

图5 温度对Pp-CALB催化肉桂醇酯化反应的影响Fig.5 Effect of temperature on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

从热力学角度来说，温度的升高有利于提高转酯反应的速率，酶促反应温度的高低对脂肪酶的分子构象也有一定的影响，进而影响酶的催化活性。反应温度对全细胞催化剂 Pp-CALB催化合成乙酸肉桂酯的影响见图5，由图可看出，当温度为50 ℃时，该体系具有较高的酯化率，这是因为在较低的温度条件下，随着温度的升高，分子扩散加速，当温度达到50 ℃的时候，达到最高酯化率，继续升高反应温度酯化率下降，表明了 Pp-CALB在高温下有一定的失活，因为高温是蛋白质变性和失活的最常见的原因[31]。因此，50 ℃是Pp-CALB催化合成乙酸肉桂酯的最适温度。

2.4 底物摩尔比对Pp-CALB催化肉桂醇转酯反应的影响

图6 底物摩尔比对Pp-CALB催化肉桂醇酯化反应的影响Fig.6 Effect of molar ratio of substrate on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

反应底物摩尔比对酶促反应进程影响较大，当某一底物的浓度固定，反应受底物摩尔比的影响十分显著[25]，实验考察了不同底物摩尔比对肉桂醇酯化率的影响，结果如图6所示。由图可知，随着底物摩尔比（乙酸乙烯酯:肉桂醇）的增加，酯化率也在增加，当底物摩尔比为2:1时，反应酯化率达到74.11%，继续增大底物摩尔比，酯化率逐渐降低，主要原因可能在于添加的乙酸乙烯酯过量，产生底物抑制效应，以使得 Pp-CALB催化性能降低。同时过多的底物加入进反应体系，不利于反应后期分离纯化，并且造成多余的浪费，故选择底物摩尔比2:1较合适。

2.5 全细胞催化剂添加量对肉桂醇转酯反应的影响

图7 不同Pp-CALB添加量对肉桂醇酯化反应的影响Fig.7 Effect of the amount of lipase on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

Pp-CALB的添加量对反应速率和经济成本有着很大的影响，由图7可知，随着酶量增加，肉桂醇的酯化率提高，当酶量由0.01 g增加到0.05 g时，酯化率稳定提升；但酶量由0.05 g增加到0.08 g时，酯化率提升不明显。原因可能是在底物浓度一定的条件下，当酶量超过0.05 g后，由于底物浓度的限制，尽管酶量增加但酯化率不会显著提高。此外在高酶浓度的催化体系中，催化剂很难维持均匀悬浮状态，存在传质阻力[32]，而且，过量的酶加入反应体系，会大大增加反应成本，故在此反应中0.05 g是比较合适的添加量。

2.6 初始水活度对全细胞催化剂合成肉桂醇酯的影响

非水相酶促反应中, 脂肪酶需要一定量的结合水来维持其活性构象的稳定，只有达到最佳水含量的要求时，蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间才能达到最佳平衡点[33]。本研究用饱和盐预平衡的方法控制全细胞催化剂 Pp-CALB的初始水活度。在室温下，将酶和底物在密闭容器中与饱和盐溶液平衡 3 d，得到具有一定初始水活度的Pp-CALB和底物，所用的饱和盐溶液包括：LiBr (aw=0.06)，LiCl (aw=0.11)，MgCl2(aw=0.33)，Mg (NO3)2(aw=0.53)，NaCl (aw=0.75)，K2SO4(aw=0.97)[34]。

图8 不同水活度对Pp-CALB催化肉桂醇酯化反应的影响Fig.8 Effect of different initial water activities on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

由图8可知，使用Mg(NO3)2饱和溶液aw=0.53处理后的 Pp-CALB和底物，肉桂醇酯化率最高达81.34%。因此，Pp-CALB催化该反应的最适水活度为0.53。

2.7 有机溶剂及无溶剂体系中肉桂醇酯合成结果比较

图9 不同溶剂环境中的合成肉桂醇酯结果Fig.9 Effect of different reaction system on the esterification of cinnamic alcohol catalyzed by Pp-CALB

选择乙酸乙烯酯为酰基供体，分别在有机溶剂及无溶剂体系中进行乙酸肉桂酯的合成。底物摩尔比（乙酸乙烯酯:肉桂醇）为2，加入3 mL有机溶剂（正己烷、正庚烷、异辛烷），0.05 g全细胞催化剂，120 r/min，50 ℃反应3 h，肉桂醇酯化效果如图9所示。由图可看出，在无溶剂体系中，肉桂醇的酯化率最高，故对于 Pp-CALB催化合成乙酸肉桂酯而言，无溶剂体系的酯化效果明显优于有机溶剂，这可能与无溶剂体系增大了底物的浓度有关，而且无溶剂体系比有机溶剂体系更具优势，可简化后续分离提纯过程。

2.8 全细胞催化剂在肉桂醇转酯反应中的操作稳定性

图10 全细胞催化剂Pp-CALB操作稳定性Fig.10 Operational stability of the Pp-CALB

为达到降低生产成本的目的，本文研究了Pp-CALB的多次重复利用，每次反应完成后，过滤Pp-CALB，然后用丙酮连续洗涤3～4次。最后将其放入干燥剂中，在室温（30±2 ℃）中保存整夜，完全干燥后再次用于下一反应[2]。由图10可知，使用全细胞催化剂Pp-CALB连续反应10个批次，第8批次反应时，肉桂醇的酯化率仍能保持在70.00%以上，因此全细胞催化剂 Pp-CALB在本实验中表现出了良好的可重复使用性。

2.9 肉桂醇酯化反应的进程曲线

图11 脂肪酶催化合成乙酸肉桂酯反应进程曲线Fig.11 Time course of esterification catalyzed by Pp-CALB and Novozyme 435

综合以上各单因素优化的结果，在无溶剂反应体系中，酶加量0.05 g（其中添加的Pp-CALB初始水活度为0.53），肉桂醇6 mmol，乙酸乙烯酯12 mmol，反应温度50 ℃，摇床转速120 r/min，反应3 h，在此条件下比较本实验室自制全细胞催化剂 Pp-CALB与Novozyme435对乙酸肉桂酯的催化效率。由图11可知，Pp-CALB与Novozyme435合成乙酸肉桂酯有一定的差距，可能的原因是全细胞催化剂比酶活小，单位重量酵母细胞表面展示的CALB蛋白较少，而且单因素之间的交互作用没有进一步优化，Pp-CALB合成乙酸肉桂酯的催化效率有进一步提高的空间。

3 结论

3.1 本研究以毕赤酵母表面展示 CALB为全细胞催化剂，构建了无溶剂体系中肉桂醇酯的绿色合成工艺。在底物摩尔比（乙酸乙烯酯:肉桂醇）为2:1，添加0.05 g初始水活度为 0.53的全细胞催化剂 Pp-CALB，50 ℃，120 r/min的条件下反应3 h，肉桂醇酯化率可达81.34%。且该全细胞催化剂重复利用性好，连续反应8次后，肉桂醇仍能达到较高的酯化率。

3.2 全细胞催化剂Pp-CALB不但具备固定化酶的特性，而且制作过程简单，有效节省了设备投资和运行费用。且构建的无溶剂体系具有条件温和，无溶剂挥发和产物更易提取等优势，是一条环境友好的酶法合成工艺路线，为优质香料的高效制备与应用奠定了基础。

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