MS、MSR基因多态性与静脉血栓栓塞症的相关性研究

赵　利，郭玉君，艾力曼·马合木提

(新疆医科大学第一附属医院心力衰竭科，乌鲁木齐　830054)

MS、MSR基因多态性与静脉血栓栓塞症的相关性研究

赵利，郭玉君，艾力曼·马合木提

(新疆医科大学第一附属医院心力衰竭科，乌鲁木齐830054)

摘要：目的探讨甲硫氨酸合酶(MS)、甲硫氨酸合酶还原酶(MSR)基因位点多态性与静脉血栓栓塞症(VTE)的关系。方法选择2016年7月-2017年12月在新疆医科大学第一附属医院住院确诊VTE的患者162例作为病例组，以同期住院的体检无VTE、且性别及年龄相匹配的患者203例作为正常对照组，应用酶联免疫吸附法检测Hcy水平；应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-PFLP)技术检测MS A2756G、MSR A66G位点多态性，分析基因位点多态性与VTE的关系。结果病例组的吸烟、腹型肥胖、高脂血症人数多于正常对照组，BMI、腰围、纤维蛋白原、D-二聚体、TG、Hcy、叶酸水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。MSR A66G的隐性模型和等位基因分布频率在病例组与正常对照组中差异有统计学意义(P<0.05)。MSR A66G基因隐性模型不是VTE的独立危险因素，而高Hcy血症、吸烟、腹型肥胖是VTE的危险因素。结论MS A2756G、MSR A66G基因多态性与VTE不存在相关性。

关键词：甲硫氨酸合酶；甲硫氨酸合酶还原酶；基因多态性；静脉血栓栓塞症

中图分类号：R543.6

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2018)05-0576-06

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.013

基金项目：国家自然科学基金(81560803)

作者简介：赵利(1983-)，女，博士，主治医师，讲师，研究方向：动静脉血栓栓塞。

通信作者：艾力曼·马合木提，女，主任医师，教授，博士生导师，研究方向：动静脉血栓栓塞，E-mail:598945190@qq.com。

本文引用：赵利，郭玉君，艾力曼·马合木提.MS、MSR基因多态性与静脉血栓栓塞症的相关性研究[J].新疆医科大学学报,2018,41(5):576-580,584.doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2018.05.013

AssociationbetweenMS,MSRgenepolymorphismsandvenousthromboembolism

ZHAOLi，GUOYujun,AlimanMahemuti

(DepartmentofCardiacFailure，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between MS,MSR gene polymorphisms and venous thromboembolism(VTE).MethodsBy retrospective analysis,162 patients diagnosed as VTE in Department of Cardiac Failure of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University between July 2016 and December 2017 were selected,while 203 cases with gender and age matched were selected as control group,using enzyme-linked immunosorbent assay to detect the blood serum Hcy levels,and PCR-PFLP technique to detect MS A2756G and MSR A66G polymorphisms.ResultsSmoking,abdominal obesity and hyperlipidemia in the proportion of patients in the case group were higher than the normal control group.BMIs,waist circumference,fibrinogen,D-dimer,Triglyceride and folic acid levels in the case group were higher than those in the normal control group(P<0.05).MSR A66G recessive model and allele distribution frequency were significantly different between the case group and the normal control group(P<0.05).MSR A66G recessive model was not an independent risk factor for VTE,but hyperHcy,smoking and abdominal obesity are the risk factors for VTE.ConclusionThere were no correlations between MS A2756G,MSR A66G gene polymorphisms and VTE.

Keywords:methione synthas;methione synthase reductase;gene polymorphisms;venous thromboembolism

静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism，VTE)是继心血管疾病、脑卒中之后的第三大危害人类健康的疾病[1]。大约25%～50%的情况下没有获得性诱发因素的影响仍发生VTE。目前一致认为同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是静脉系统血栓形成的危险因子。Hcy向蛋氨酸转化的再甲基化通路中有三个关键酶：亚甲基四氢叶酸还原酶、甲硫氨酸合酶(Methione Synthase，MS)和甲硫氨酸合酶还原酶(Methione synthase reductase，MSR)，其中MS、MSR基因多态性与VTE的研究鲜有报道，结论存在分歧。本研究以VTE患者为主要研究对象,从基因水平分析MS及MSR基因位点多态性与VTE的关联,旨在发现VTE的高危风险模式，为临床提供预警信息。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2016年7月-2017年12月在新疆医科大学第一附属医院住院确诊VTE的患者162例作为病例组，以同期住院的体检无VTE、且性别及年龄相匹配的患者203例作为正常对照组。病例组纳入标准：VTE的诊断标准[2]：(1)放射性核素肺通气-灌注扫描显示肺灌注缺损和/或稀疏沿血管呈肺段分布，或呈楔形、凹形；肺通气-灌注显象不匹配。(2)肺动脉CT显示各级肺动脉内有阻塞和/或不规则偏心性充盈缺损。(3)肺动脉造影征象肺动脉及其分支充盈缺损；或栓子堵塞造成的截断现象；或肺野无血流灌注，不对称性肺血管纹理减少；或栓塞区出现“剪枝征”；肺动脉分支充盈、排空延迟。(4)下肢血管超声和/或放射性核素下肢深静脉显象下肢静脉内血栓征象。(5)获得入选者知情同意并签署知情书。正常对照组纳入标准：无VTE家族史、无动脉疾病(脑卒中、冠心病和周围动脉疾病)、无妊娠及肿瘤病史。排除标准：VTE组及对照组中临床资料不全以及同时合并以下疾病，包括：(1)怀疑为恶性肿瘤、气体、羊水或脂肪栓塞患者；(2)合并急、慢性病毒、细菌感染；(3)结缔组织疾病；(4)创伤、手术、长期制动、口服避孕药和肝、肾功能异常者；(5)患有血液系统疾病；(6)慢性阻塞性肺病；(7)急、慢性动脉血栓栓塞患者；(8)未获得知情同意者。本研究已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。

1.2方法依照调查问卷收集资料。体质指数(body mass index，BMI)：BMI=体质量/身高2(kg/m2)。高血压病按高血压指南的诊断标准[2]。2型糖尿病按照WHO糖尿病诊断标准。腹型肥胖：女性腰围>85cm，男性腰围>90cm，即定义为腹型肥胖。高脂血症按指南标准判断[3]。吸烟者指每日吸烟超过5支，连续或累积吸烟者6个月或以上者。饮酒者是指周饮酒至少2次，连续饮酒1 a以上。生化指标的检测包括空腹血糖、血低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)、甘油三脂(Triglyceride，TG)，总胆固醇(Total Cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)、纤维蛋白原、D-二聚体等，由新疆医科大学第一附属医院医学检验中心统一检测。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELESA)法使用 Ultra-Mark 型酶联仪(美国 Bio-Rad 公司)检测血浆 Hcy 、叶酸、维生素B12的浓度，若血浆Hcy浓度>15 μmol/L时，定义为高同型半胱氨酸血症(高Hcy血症)。外周血白细胞抽提DNA：使用血液基因组 DNA中计量抽提试剂盒提取基因组DNA。聚合酶链反应：首先在Pubmed网站Genebank栏目中查找并核对MS、MSR全基因序列，再以rs1805087、rs1801394的rs序列为参考，使用Primer5.0软件设计各个位点的上引物和下引物。PCR-RFLP分析:PCR扩增条件：首先进行的是预变性：95℃温度下反应5min；再按下列步骤循环反应34次：95℃变性30s，退火30s(其中退火温度分别为rs1805087为44.7℃、rs1801394为62℃，72℃延伸30s，末次循环后的PCR产物再经72℃延伸5min，最后4℃冷却1min即得到扩增的双链DNA。酶切实验及凝胶电泳基因型鉴定:rs1805087位点的内切酶为Hae III、rs1801394位点的内切酶为Nsp I。内切酶反应结束后，在2%琼脂糖凝胶上电泳消化片段，由EB替代品染色剂完成，最后用凝胶成像系统判断结果。各基因位点每个基因多态性分别抽取20个标本进行直接DNA测序。

2　结果

2.1病例组与正常对照组临床资料的比较病例组的吸烟、腹型肥胖、高脂血症人数多于正常对照组，BMI、腰围、纤维蛋白原、D-二聚体、TG、Hcy、叶酸水平均高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组的饮酒、高血压、糖尿病、肌酐、TC、HDL、LDL、VitB12水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　病例组与正常对照组临床资料的比较

2.2MS、MSR基因PCR扩增及酶切结果MS基因A2756G突变位点扩增后，经Hae III酶切后，分为3种基因型：野生型AA型：仅有189bp一个条带，杂合型AG型：有189bp、159bp、30bp三个条带，突变型GG型：仅有159bp、30bp两个条带，见图1、2。MSR基因A66G突变位点扩增后，经Nsp I酶切后，分为3种基因型：野生型AA型有126bp、25bp两个片段；杂合型AG型有151bp、126bp和25bp三个片段，突变型GG型仅有151bp一个片段，见图3、4。

图1　MS基因A2756G多态性 PCR 产物各基因型酶切片段电泳结果

图2　MS基因A2756G 多态性 PCR 产物测序图(箭头所指为突变位置碱基)

2.3MS、MSR多态基因性Hardy-Weinberg平衡检验对MS、MSR突变的基因型频数统计，本实验的病例组和正常对照组人群的各基因位点的基因型频数分布与预期值相比较，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，说明具有群体代表性，来自同一遗传平衡体，见表2、3。

图3　MSR基因A66G多态性PCR产物各基因型酶切片段电泳结果

表2　MS A2756G位点基因型频率Hardy-Weinberg检验

2.4MS、MSR基因多态性在病例组和正常对照组中的频率分布MS A2756G、MSR A66G在病例组与正常对照组中的基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。2组的MS A2756G的显性模型、隐性模型、相加模型、等位基因分布频率和MSR A66G显性模型、相加模型比较差异无统计学意义(P>0.05)。MSR A66G的隐性模型和等位基因分布频率在病例组与正常对照组中差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3　MSR A66G位点基因型频率Hardy-Weinberg检验

2.5MSRA66G隐性模型与VTE的非条件Logistic回归分析为了控制VTE人群混杂因素的影响，以是否患有VTE(1=是，0=否)作为因变量，将是否为高Hcy血症(1=是，0=否)，是否吸烟(1=是，0=否)，是否腹型肥胖(1=是，0=否)，是否为MSR A66G基因隐性模型(1=GG，0= AA + AG)作为自变量引入模型进行非条件Logistic回归分析，分析上述因素与VTE发病之间的关联性。校正后，MSR A66G基因隐性模型不是VTE的独立危险因素，而高Hcy血症、吸烟、腹型肥胖是VTE的危险因素，见表5。

表4　MS、MSR基因多态性在病例组和正常对照组中的频率分布/例(%)

表5　MSR A66G隐性模型与VTE的非条件Logistic回归分析

3　讨论

VTE是一种高发病率、高病死率的疾病，是多种因素影响的结果，最主要方面为基因和环境因素相互作用。众所周知，Hcy是静脉血栓形成的危险因子，血浆Hcy 的水平去除各种环境营养因素影响，代谢酶的基因突变引起酶缺陷或活性下降从而导致Hcy升高是静脉血栓发病的主要原因之一。Hcy代谢通路有三个关键酶：亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、MS和MSR。MTHFR基因多态性已明确与VTE发病存在关联。然而，MS和MSR基因多态性研究较少，且结论不一。MS和MSR基因突变是否能引起Hcy水平升高从而造成VTE发病增加，是本研究分析的目的。

MS 基因突变研究的较多的是MS A2756G 突变，A→G的突变可导致919 位密码子D→G的错义突变，MS 2756G等位基因在不同人群中的频率分别约为：马来西亚为17.9%，日本为17.3%，西班牙为18.8%，高加索19.9%，中国8.5%，泰国11.8%，韩国13.1%；而突变频率较高的是非洲23.8%，印度北部24%。在中国范围内，MS A2756G位点多态性分布在中国人群中以野生型AA为主，突变型GG等位基因低，具有中国人群的特征。MS基因A2756G 位点的突变与VTE的研究较少，Zoe等[4]研究表明，G等位基因分布频率在病例组低于正常对照组，杂合子降低Hcy浓度，提示携带G等位基因减少VTE事件，可能是VTE的保护性因子。而Salomon等[5]和Yates等[6]的研究均显示MS A2756G多态性不是VTE的危险因子。本研究结果显示，MS A2756G各基因型和各遗传模型在病例组和正常对照组间的分布频率都无差异，G等位基因频率分布无差别，未显现GG突变型在病例组的表达频率多或少，故MS A2756G基因多态性与VTE不存在关联，考虑可能与MS基因A2756G 位点突变未能引起血浆Hcy水平升高有关。

图4　MSR基因A66G多态性 PCR 产物测序图(箭头所指为突变位置碱基)

MSR是保持MS活性的关键酶，其活性或浓度降低均可导致Hcy甲基化代谢途径障碍，导致不同程度的Hcy浓度升高。目前研究较多的常见突变位点为MSR A66G。MSR A66G等位基因突变频率在30%～50%，我国10省市人群66G等位基因频率和G66G基因型频率分别为25.7%和6.6%。Suzuki等[7]研究显示，MSR A66G基因多态性与头颈部肿瘤无关，但Zhang等[8]研究显示，MSR 66AA型降低头颈部肿瘤的发生，且等位基因A是保护性因子。Brown等[9]研究报道，MSR 66GG型患者调整了性别的干扰因素后有较高早发冠心病的风险，但无相应的Hcy水平升高。多伦多大学一项研究[10]揭示，女性VTE患者的MSR 66GG型频率高于对照组(32.55%比27.13%)，但无统计学差异。Naushad 等[11]研究显示，MSR 66GG是下肢深静脉血栓的危险因子，且在MTHFR A1298C、C677TA杂合型并存时进一步增加下肢深静脉血栓形成风险。本研究结果显示，病例组和正常对照组各基因型频率分布差异无统计学意义，经回归分析显示无关联性，原因有：与VTE存在关联的MSR突变基因可能不是A66G；MSR A66G基因多态性不升高Hcy水平，其与VTE可能不存在相关性，但不除外在增加样本量的情况下出现有统计学意义的情况，有待进一步扩大样本量探讨分析。

本研究结果显示，高Hcy血症、吸烟、腹型肥胖是VTE的危险因素，与Walte等[12]、石朝利等[13]、胡雪梅等[14]研究结论一致。本研究在收集资料过程中严格纳入标准，未能获得充足的样本例数，目前仍在收集高质量的样本，并进行长期的随访观察，对Hcy代谢相关酶基因多态性与VTE的预后研究提供参考。

综上所述，血浆高Hcy、吸烟及腹型肥胖是VTE人群的独立危险因素，可能与VTE的发生相关。MS A2756G、MSR A66G基因多态性不是VTE人群的遗传易感因素。预防因不良生活方式导致的获得性危险因素，并预测和干预高危人群，对提高VTE患者生活质量可起到重要临床意义。识别与VTE相关的特殊突变基因，选择性采取预防，一定程度上能够及时给予治疗，从而减少死亡的发生。

[收稿日期：2017-10-23]

(本文编辑王艳)