自制抗人磷脂酶A2受体抗体ELISA试剂盒的临床应用评价

黄莉敏，张大准，王艳，张巧，梁伟，张永顶，熊祖应

1 北京大学深圳医院 肾内科，广东 深圳 518035

2 深圳市伯劳特生物制品有限公司，广东 深圳 518054

膜性肾病 (Membranous nephropathy，MN)是一个病理学概念，根据病因可分为原发性膜性肾病 (Primary membranous nephropathy，pMN) 和继发于全身其他病因的继发性膜性肾病 (Secondary membranous nephropathy，sMN)。两者临床表现相似，仅从临床表现不能进行鉴别，但两者治疗方案差异巨大，如何鉴别pMN和sMN一直困扰着国内外肾脏病专家[1-2]。2009年，Beck等[3]在pMN患者血清中检测出抗 M型磷脂酶 A2受体(Phospholipase A2 receptor，PLA2R)抗体，抗体阳性率可达约70%；而健康人、sMN病人及其他肾病患者血清抗体均阴性，提示抗PLA2R抗体可能是pMN特异性标志物。而国内外相关研究也相继证实抗PLA2R抗体在膜性肾病中的作用[4]。

目前市场上仅有欧蒙公司能生产该 ELISA试剂盒，本研究通过自主研发，自制了 PLA2R抗体定量检测 ELISA试剂盒，并对试剂盒性能进行了评价。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 pMN组

北京大学深圳医院肾内科2010年5月至2016年2月住院患者，经肾穿刺活检病理组织检查，通过光镜、免疫荧光、电镜确诊为 MN；并通过临床资料，结合实验室检查，排除肿瘤、药物、感染及其他自身免疫病等引起的继发性膜性肾病。于肾穿刺当日清晨留取患者血清标本，符合标准的276例pMN患者入组。

1.1.2 非pMN组

随机选取同期诊断为其他肾脏病及健康体检者，共122例入组。包括继发性膜性肾病 (sMN)12例，肾功能不全9例，糖尿病患者8例，系统性红斑狼疮6例，健康体检者87名 (年龄在20–70岁之间)。

1.2 方法

1.2.1 样本收集

所有入组患者于清晨空腹状态下采集静脉血，于3 000 r/min、4 ℃离心10 min。分离血清，并分装于–80 ℃冰箱待用。

1.2.2 抗原及校准品制备

抗原为HEK293细胞表达的重组PLA2R全长蛋白 (由美国 SHENZHEN BLOT BIOTECHWISCONSIN，LLC公司提供，HEK293细胞表达)。校准品通过德国欧蒙公司 (E150522BD) 检测膜性肾病患者血清，选取抗体滴度大于1 500 RU/mL的阳性血清，将阳性血清混合后以阴性血清进行不同比例稀释作候选校准品原料血清，再通过注册试剂盒重复检测候选校准品血清3次，选择与注册试剂盒校准品OD值无差异 (P>0.05) 的校准品候选血清。入选校准品血清以校准品稀释液稀释 101倍即得自制试剂盒校准品 (市售试剂盒校准品滴度2、20、100、500、1 500 RU/mL)。

1.2.3 自制ELISA试剂盒

用0.05 mol/L CB缓冲液稀释重组PLA2R抗原至1 μg/mL，加入酶标板，每孔100 μL，于4 ℃包被过夜。TBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。每孔加入1%的 BSA，150 μL/孔，室温 (18–26 ℃) 封闭30 min。将酶标板拍干，置于室温 (18–26 ℃)、湿度<15%条件下干燥2–4 h，封装并保存于4 ℃备用。

1.2.4 自制ELISA试剂盒检测血清抗体滴度

待检样本用 Tris+1% BSA稀释液按 1∶101稀释 (Sigma公司)，取包被好的酶标板条，室温平衡之后，加入稀释好的样本和校准品以及对照品，每孔100 μL，室温温育30 min；然后洗涤3次(TECAN洗板机)，加入1∶6 000稀释好的HRP标记兔抗人IgG (Sigma公司)，每孔100 μL，室温温育30 min；洗涤3次，加入底物TMB，每孔100 μL，室温避光反应30 min；加入0.5 mol/L的H2SO4，每孔100 μL终止反应。用酶标仪(TECAN NanoQuant) 测定450 nm和620–650 nm任一波长处的吸光度值，以450 nm波长处的吸光度值减去620–650 nm 波长处的吸光度值记为各孔的OD值。然后以校准品的浓度值 2、20、100、500、1 500 RU/mL作为x轴，各校准品对应的OD值作y轴，进行曲线回归拟合，根据拟合的标准曲线方程计算出各待测样本的浓度。

1.2.5 注册试剂盒测血清抗体滴度

该检测试剂盒购自德国欧蒙公司(E150522BD)，实验操作按试剂盒内说明书进行。并根据说明书将血清抗体滴度<14 RU/mL记为阴性，将抗体滴度>20 RU/mL记为阳性。若抗体滴度介于 14–20 RU/mL则为疑似阳性，疑似阳性患者选取同期血清进行多次检测，>20 RU/mL记为阳性。

1.3 统计学分析

统计学分析均用SPSS 19.0，以α=0.05为检验水准，P<0.05说明差异有统计学意义。

1.3.1 准确度

用试剂盒内阳性对照直接进行检测，重复测量 3次后，其平均值记作，根据公式：测量偏差=(–理论值)/理论值×100%，结果相对偏差在±15%区间内。

1.3.2 检测限

用样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的吸光度值 (A值)，计算其平均值 () 和标准差 (s)，得出+2s所对应A值，根据试剂盒所用校准品校准曲线方程，将+2s所对应A值代入上述方程中，求出对应浓度值，即为检测限，其结果不高于2 RU/mL。其中自制试剂盒记为A1，市售试剂盒记为A2。

1.3.3 测量系统线性范围

将接近线性范围上限的校准品用样本稀释液倍比稀释为5种浓度，其中低值样本需接近线性范围下限。按试剂盒说明书进行操作，将每一浓度样本重复检测2次，计算其浓度平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数R2，结果线性范围2–500 RU/mL，线性相关系数R2值不低于0.99。

1.3.4 重复性

用2个浓度水平样本各重复检测10次，计算10次测量浓度结果平均值和标准差s，根据如下公式 (1) 得出变异系数 CV，结果变异系数(CV) 不高于 15%。其中自制试剂盒记为 CV1，市售试剂盒记为CV2。

式中，CV：变异系数；s：10次测量结果标准差；：10次测量结果平均值。

1.3.5 批间差

用3个批号试剂盒分别检测同一份样本，各重复10次，计算30次测量浓度值平均值和标准差s，根据公式 (2) 得出变异系数CV，结果变异系数 (CV) 不高于15%。其中自制试剂盒记为CV1，市售试剂盒记为CV2。

1.3.6 稳定性检测

朋友是个电影迷，却从来只喜欢看外国电影。每周六晚，中央台的“佳片有约”，他雷打不动地看了很多年。为此，他还培养出了女儿，从小一直跟他看电影，也成了一个电影迷。然而，这一两年，他不看了，明明知道有好电影，明明自己也有闲时间，却无论如何也提不起兴趣。有时候，勉勉强强看半截，就呼呼地睡着了。过后，又捶胸顿足，直呼自己“老了，老了”。

试剂盒在37 ℃恒温箱放置6 d后，2–8 ℃贮存365 d后，取试剂盒检测准确度、检测限、线性范围、重复性，应符合以上1.3.1–1.3.5要求。

2 结果

2.1 自制试剂盒性能评价结果

自制试剂盒测量偏差如表 1所示，市售试剂盒测量偏差如表2所示，测量偏差均在±15%区间内。两组测量偏差比较，P>0.05，不认为两组试剂盒的测量偏差存在统计学差异。

检测限评估结果见表 3及表 4，试剂盒检测限均不高于2 RU/mL。

自制试剂盒与市售试剂盒线性范围2–500 RU/mL，线性相关系数R2值均不低于0.99，如图1所示。

对两种试剂盒进行重复性检测，自制试剂盒在100 RU/mL时的批内变异系数为CV1a=5.98%，在500 RU/mL时的批内变异系数为CV1b=4.27%。市售试剂盒在 100 RU/mL时的批内变异系数为CV2a=3.85%，在500 RU/mL时的批内变异系数为CV2b=1.31%。

表1 三个不同批次自制试剂盒准确度检验Table 1 A test about accuracy of 3 different batches homemade kits

表2 三个不同批次市售试剂盒准确度检验Table 2 A test about accuracy of 3 different batches commercial kits

表3 三个不同批次自制试剂盒检测限检验Table 3 A test about detectability of 3 different batches homemade kits

表4 三个不同批次市售试剂盒检测限检验Table 4 A test about detectability of 3 different batches commercial kits

图1 试剂盒线性评估Fig. 1 Liner assessment for ELISA kit. The figture of “LOT:150727, LOT:150803, LOT:150914” represent liner assessment for homomade ELISA kits, while the “E160821AD, E161010BH, E160204AH” are liner assessment for commercial ELISA kits.

检测自制试剂盒批间差，得出变异系数CV1=7.95%，市售试剂盒批间差CV2=4.39%。两种试剂盒3个批间差均在15%以内。

试剂盒分别在37 ℃恒温箱放置6 d后，4 ℃贮存365 d后，取试剂盒检测准确度、检测限、线性范围、重复性。结果见表5，试剂盒在37 ℃恒温箱放置6 d，2–8 ℃放置365 d后，试剂盒检测准确度、检测限、线性范围、重复性均符合要求。

2.2 与国外同类试剂盒对比

用EUROIMMUN Anti-PLA2R ELISA试剂盒和自制试剂盒同时测定 276份 pMN患者血清和122份非pMN组血清，检测结果如表6所示。欧蒙试剂盒检测pMN患者血清敏感度为51.81%，特性度为 100%；自制试剂盒检测敏感度为50.36%，特异度为 100%。自制试剂盒与市售商品化试剂盒比较，阳性符合率 97.2%，阴性符合率为100%，总体符合率有98.9%，两种试剂盒的差异不显著 (P=0.583，P>0.05）。

2.3 血清抗PLA2R抗体阳性组与阴性组基本资料与实验室数据比较

2010–2016年在我科住院并行肾穿刺活检病理和临床诊断，共纳入符合标准的pMN患者276例，以自制试剂盒测量抗体滴度，其中抗PLA2R抗体阳性患者139例，阴性患者137例，pMN患者血清抗 PLA2R抗体阳性率为 50.36%。通过统计学分析发现阴性组与阳性组患者血清肌酐无统计学差异，但阳性组患者年龄、尿蛋白定量高于阴性组患者，阳性组患者血白蛋白低于阴性组(P<0.05)(表7)。进一步分析抗PLA2R抗体滴度分别与尿蛋白、血白蛋白的相关性，通过线性回归，得到如图2A、2B所示散点图，发现抗PLA2R抗体滴度与尿蛋白呈正相关，与血白蛋白呈负相关。

3 讨论

有效鉴别pMN与sMN对于疾病治疗具有重要指导意义[5-6]。临床上，当病理诊断是MN时，如果能排除各种继发性病因，则可作出 pMN诊断。导致MN的继发因素常常复杂多变，如某些肿瘤继发MN，有时甚至在MN发生后数月至数年后才表现出来，这给临床排除继发病因带来较多困难；再如膜性肾病合并乙型肝炎病毒感染与乙型肝炎病毒引起sMN鉴别，很难通过病理或其他实验室检查得以鉴别[7-9]。鉴别pMN和sMN的特异性抗 PLA2R抗体的出现无疑为临床医生带来新希望。研究发现，超过70% pMN患者血清PLA2R抗体阳性，而 sMN患者则该抗体很少阳性；且血清抗 PLA2R抗体滴度变化先于尿蛋白变化，与病情呈平行关系，可指导临床调整治疗方案[10-14]。

表5 自制试剂盒在不同温度放置不同时间后的稳定性评估Table 5 Homemade kits stability assessment

表6 自制试剂盒与注册试剂盒检测结果Table 6 Comparison of the homemade kit and commercial kit

本课题组研究发现在特发性膜性肾病患者中，血清抗体水平与蛋白尿水平呈正相关，与血清白蛋白水平呈负相关，血清抗PLA2R抗体的检测有利于辅助病情的诊断与疾病严重情况的预测。本课题组自制 PLA2R抗体试剂盒可定量检测患者血清抗PLA2R抗体，进而鉴别pMN和sMN，该试剂盒具有准确、快捷的特性，为确诊pMN提供证据。同时可监测病人血清PLA2R抗体滴度水平，评估患者病情活动性，从而调整治疗方案。

表7 血清抗PLA2R抗体阳性组与阴性组基本资料Table 7 The baseline data of positive group and negative group

图2 血清抗PLA2R抗体与24 h蛋白尿 (A) 和血清白蛋白 (B) 的关系Fig. 2 Relationship between serum anti-PLA2R antibody and 24 h proteinuria (A), serum albumin (B).

评估该试剂盒基本性能发现，自制试剂盒诊断检测pMN敏感性50.36%，特异性100%，在4 ℃保存12个月，批间和批内稳定性良好，能够满足临床需要。比较本试剂盒与目前市面上唯一注册产品EUROIMMUN Anti-PLA2R ELISA试剂盒符合率差异无统计学意义。但由于市售试剂盒购买受条件限制，未进行两个试剂盒的稳定性比较，需进一步完善。

由于抗PLA2R抗体IgG无国际约定参考测量程序和校准品，因此我们用适当校准等级传递方案，将校准品溯源至EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG的Anti-PLA2R ELISA(IgG)检测方法。虽然检测临床样本时有 4份血清样本出现差异，但整体符合率高度一致，部分差异原因可能系两种试剂盒所选抗原片段部分不同所致。

综上所述，依据自制试剂盒检测病人抗PLA2R抗体滴度水平，不仅可区别pMN和sMN，还可预测患者病变活动性，为提高pMN诊断准确率，提高治愈率创造条件[15-16]。本试剂盒符合行业内相关标准，与注册试剂盒比对结果高度一致，差异无显著意义，能满足临床应用需要。同时，自制试剂盒操作简便、质量稳定，填补了国内空白，为MN患者提供了一种有效、可靠的检测方法。本研究也将进行更大样本量的验证，寻求第三方验证，以及临床前瞻性研究，以进一步完善自制试剂盒的性能。

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