马铃薯发酵产乙醇的工艺条件研究

代淑梅，李秋园*

（中溶科技股份有限公司研发中心 河北省非粮乙醇工程技术研究中心，河北 唐山 064000）

目前全球能源供应日益紧张，从国家能源和战略安全考虑，研究新型能源替代石油尤为迫切，而通过发酵生产乙醇是一种重要的可再生能源获得途径。一直以来，乙醇作为一种洁净的燃料备受关注，无论是单独作为汽车的燃料，还是部分替代燃油，都被认为是最合适的化石燃料替代物。我国是世界最大的马铃薯生产国，马铃薯来源广，且其块茎含有丰富的淀粉（约占其干质量的60%～80%），经处理后是天然良好的培养基[1]。因此，利用其发酵生产燃料乙醇是可行的。目前国内外对发酵马铃薯产乙醇工艺研究较多，在低浓度底物条件下，乙醇产量可达到6.20%vol，发酵率可达82.0%[2]；在高底物浓度条件下，乙醇产量可达16.61%vol[3]；同时还有学者对其进行了同步糖化发酵工艺的研究[4]。但工艺优化主要关注温度、pH、培养基配方等常规参数，对酶系复配对乙醇产量影响的研究不多，因此本试验在继续深入对马铃薯液体发酵生产乙醇各影响因子的考察及其工艺优化研究的基础上，通过对不同酶系复配比例的研究，以廉价培养基，结合相关工艺参数的优化，寻找提高马铃薯液体发酵生产乙醇的最优条件，提高乙醇产率，缩短发酵周期，从而降低乙醇的生产成本，为我国马铃薯发展乙醇产业提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马铃薯干粉：市售鲜马铃薯经60℃烘干后粉碎；耐高温淀粉酶（10 000 U/g）、糖化酶（4 500 U/g）、纤维素酶（6 000 U/g）：诺维信（中国）生物技术有限公司；活性干酵母：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；泡敌（优级品）：广州恒宇化工有限公司；尿素（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

WHL-65B立式干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；0.40 mm孔筛：绍兴市上虞道墟燕光仪器设备厂；GC-7890气相色谱仪：上海传昊仪器有限公司；BS-2F振荡培养箱：金坛区水北科普实验仪器厂；DH-360电热恒温培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

料水比对乙醇发酵的影响：称取120 g马铃薯干粉过0.40mm孔筛，以不同的料水比（1∶4.0、1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5、1∶6.0g∶mL））加入500 mL三角瓶中，调节pH值至5.0，在65 ℃条件下分别加入50 U/g耐高温淀粉酶、糖化酶和纤维素酶，处理1h后，向其中加入0.43g尿素，0.06%泡敌消泡剂，于115℃条件下湿热灭菌20 min，接入已活化的酵母菌，于30℃培养，测定发酵72 h时发酵液中乙醇含量。

酶制剂添加量对乙醇发酵的影响：按1.3.1部分确定的最佳料水比，在相同条件下分别添加不同量的耐高温淀粉酶10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g、30 U/g）、糖化酶（120 U/g、140 U/g、160 U/g、180 U/g、200 U/g）和纤维素酶（5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g、25 U/g），测定发酵72 h时发酵液中乙醇含量。

发酵温度对乙醇发酵的影响：在确定的最佳料水比和酶制剂添加量的条件下，按同样的处理方法分别于不同温度条件下（27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃）进行发酵培养，测定72 h时发酵液中乙醇含量。

消泡剂添加量对乙醇发酵的影响：在确定的最佳料水比、酶制剂添加量及发酵温度的条件下，按同样的处理方法进行培养，分别加入不同量的消泡剂（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%），测定发酵72 h时发酵液中乙醇含量。

酵母接种量对乙醇发酵的影响：在已确定的最佳条件下，向发酵液中接入不同接种量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）的酵母菌，测定发酵72 h时发酵液中乙醇含量。

发酵时间对乙醇发酵的影响：在已确定的最佳条件下，于不同时间（48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）测定发酵液中乙醇含量。

1.3.2 正交试验

根据单因素试验结果，选取料水比（A）、发酵温度（B）、酵母接种量（C）、发酵时间（D）为考察因素，以发酵液中乙醇含量为评价指标，设计4因素3水平L9（34）正交试验，因素与水平见表1。

表1 发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of fermentation conditions

1.3.3 测定方法

乙醇含量和淀粉转化率的测定按照参考文献[5]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料水比对乙醇发酵的影响

在马铃薯的发酵过程中影响比较大的因素是加水量。在乙醇生产过程中，要求醪液均匀，黏度低，易于输送和酵母发酵。但随着固形物含量的提高，醪液的黏度迅速增加，会使醪液的搅拌、输送、加热和冷却都十分困难。同时水也是反应物之一，在原料分子周围没有足够的水参与反应，最终造成醪液液化和糊化反应不均匀和不彻底，引起原料利用率下降，因此，选择合适的料水比是实现马铃薯乙醇发酵的关键一步[6]。

图1 料水比对发酵产乙醇的影响Fig.1 Effect of material to water ratio on ethanol production

由图1可知，当料水比为1∶4.0（g∶mL）时，发酵液中乙醇含量最高。随着料水比进一步增大，乙醇含量呈现先缓慢后加快下降的趋势；淀粉转化率呈先快速后缓慢上升的趋势[2]。综合可知，料水比为1∶5.0（g∶mL）时乙醇含量和淀粉转化率均较高，因此选择料水比为1∶4.5、1∶5.0、1∶5.5（g∶mL）进行正交试验。

2.1.2 酶制剂添加量对乙醇发酵的影响

酶制剂添加量的多少直接影响发酵的效果。酶制剂添加量太少，导致淀粉糖化速度慢或糖化不完全，不利于发酵；若酶制剂添加量太多，又造成浪费提高生产成本。

图2 耐高温淀粉酶添加量对发酵产乙醇的影响Fig.2 Effect of high temperature resistant amylase addition on ethanol production

由图2可知，添加耐高温淀粉酶后，马铃薯中的淀粉链被水解为糊精和葡萄糖，从而使淀粉浆的黏度降低，有利于产乙醇发酵。在耐高温淀粉酶添加量为15 U/g时，乙醇含量最高。当耐高温淀粉酶添加量＞15 U/g后，乙醇含量变化不大。考虑到发酵成本，因此选择耐高温淀粉酶添加量为15 U/g较为适宜。

图3 糖化酶添加量对发酵产乙醇的影响Fig.3 Effect of glucoamylase addition on ethanol production

糖化酶添加量直接影响乙醇发酵过程。糖化酶添加量过少，则糖化不完全，不利于提高淀粉的利用率；糖化酶添加量过多，葡萄糖糖浓度过高会对酵母的发酵产生抑制作用，影响酒精的生成，延长发酵生产的周期[7]。由图3可知，糖化酶添加量较低时，发酵液中乙醇含量随糖化酶添加量的增加而增大。当糖化酶添加量达到160 U/g后，乙醇含量变化不大。推测是因为糖化酶添加量较低时，糖化速度较慢，导致糖化和发酵都不完全。糖化酶添加量较高后会使发酵前期速度加快，对最终的乙醇含量基本没有影响[7]。考虑到发酵生产成本，因此选择糖化酶添加量为160U/g较为适宜。

图4 纤维素酶添加量对发酵产乙醇的影响Fig.4 Effect of cellulase addition on ethanol production

由图4可知，随着纤维素酶添加量的增加，发酵液中乙醇含量增大。但当其添加量超过10 U/g后，乙醇含量变化不大。考虑到生产成本，选择纤维素酶添加量为10 U/g较为适宜。

2.1.3 发酵温度对乙醇发酵的影响

温度是酵母发酵产酒的一个重要指标，也对酵母体内产酒相关酶系的形成和活性有重要影响。

由图5可知，随着发酵温度的升高，发酵液中乙醇含量相应增加，当发酵温度为30℃时，乙醇含量达到最大；继续升高发酵温度，乙醇含量反而降低。因此选择发酵温度为29℃、30℃、31℃进行正交试验。

图5 发酵温度对发酵产乙醇的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on ethanol production

2.1.4 消泡剂添加量对乙醇发酵的影响

泡沫产生与喷料问题是发酵过程中遇到比较大的问题，在加入消泡剂后该问题能得到很大的改善，但是过多的消泡剂可能对乙醇发酵的过程产生抑制作用。

图6 消泡剂添加量对发酵产乙醇的影响Fig.6 Effect of defoaming agent addition on ethanol production

由图6可知，消泡剂添加量从0.02%增至0.06%时，发酵液中乙醇含量也随之增加，虽然增长幅度不明显，但能有效抑制发酵过程中泡沫的产生及喷料现象。当消泡剂的用量继续增加时，乙醇含量开始出现逐步降低的趋势。因此选择添加0.06%的消泡剂较为适宜。

2.1.5 酵母接种量对乙醇发酵的影响

发酵过程中，酵母的活性受到接种量大小的影响[8-10]。接种量过小，酵母菌数量不足，繁殖代数增多，容易老化和染菌；接种量过大，酵母菌老化严重，影响乙醇的发酵。

由图7可知，在酵母接种量为0.2%～0.4%时，乙醇含量随酵母接种量的增加而增大。当接种量超过0.4%时，乙醇含量有所下降，原因可能过高的接种量引起酵母菌种老化直接影响到乙醇的发酵生产。因此选择酵母接种量0.2%、0.4%、0.6%进行正交试验。

图7 酵母接种量对发酵产乙醇的影响Fig.7 Effect of yeast inoculum on ethanol production

2.1.6 发酵时间对乙醇发酵的影响

整个发酵过程中另一个对产酒量有重要影响因素就是发酵时间。发酵时间太短，可发酵性糖的利用不完全，残糖量高，原料利用率低；发酵时间过长，则会引起产物分解，乙醇挥发，不利于分离，而且容易产生酸败，产生更多的副产物抑制发酵的进行[11-15]。

图8 发酵时间对发酵产乙醇的影响Fig.8 Effect of fermentation time on ethanol production

由图8可知，发酵时间48 h时乙醇含量较低；随着发酵时间的延长，乙醇含量有所增加，发酵时间72 h时乙醇含量较高；但发酵72 h后乙醇含量增加比较缓慢。因此选择发酵时间60 h、72 h、84 h进行正交试验。

2.2 正交试验

表2 发酵工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

续表

由表2可知，影响马铃薯乙醇发酵条件的主次因素排序为A＞B＞C＞D，即料水比影响最大，其次是发酵温度和接种量，发酵时间影响最小；比较k值大小可知，马铃薯发酵乙醇的最优组合为A2B2C3D3，即料水比为1:5.0（g∶mL），酵母接种量为0.4%，在31℃条件下发酵84h。在此最佳条件下进行验证试验，发酵液中乙醇含量为9.06%vol。

3 结论

本研究通过单因素及正交试验对马铃薯处理液发酵制乙醇工艺进行了优化。最终确定出马铃薯糖化发酵制乙醇优化工艺条件为发酵温度31 ℃，料水比1∶5.0（g∶mL），耐高温淀粉酶添加量15 U/g、糖化酶添加量160 U/g、纤维素酶添加量10 U/g，酵母接种量0.6%、发酵时间为84 h，在此条件下优化后的发酵液中乙醇含量可达到9.06%vol。

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