儿茶素及表儿茶素对老化啤酒中晚期糖基化终末产物的抑制作用

陈媛媛，李艳丽，罗 庆，唐诗淼，冯年捷，赵今月，4，钟晓凌，吴 茜*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068；2.三峡食品药品检验检测中心，湖北 宜昌 443005；3.湖北工业大学 材料与化学工程学院，湖北 武汉 430068；4.随州市二月风食品有限公司，湖北 随州 431518）

非酶糖基化（nonenzymatic glycosylation，NEG）是一系列复杂的非酶促反应，又称美拉德反应（Maillard reaction），是还原糖和游离氨基酸残基在非酶促条件下反应形成Schiff碱和Amadori产物等早期糖基化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物advanced glycosylation end products，AGEs），也是食品加工、储藏和运输过程中发生的重要反应之一[1]。非酶糖基化反应在生物体内广泛而缓慢地进行着，其可导致蛋白质功能降低和老化，进而使机体组织发生衰老和病变。AGEs是一组具有荧光性和非荧光性结构的复杂异质产物如Nε-羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyl lysine，CML），Nε-羧乙基赖氨酸（Nε-carboxyethyl lysine，CEL），戊糖苷，精氨嘧啶（argpyrimidine，ArgP），乙二醛赖氨酸二聚体和甲基乙二醛赖氨酸二聚体等[2]）。外源性AGEs（食品中）是内源性AGEs（体内）的重要来源，外源性AGEs约有10%进入血液循环，其中1/3通过肾脏排出，剩余2/3通过共价键与组织结合蓄积在体内，进而诱发各种疾病（如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化或糖尿病及其众多并发症[3]）。

随着经济全球化发展，啤酒运输储存周期加长。已有研究表明，因含有多种氨基酸及碳水化合物，啤酒老化过程中会形成种类繁多的α-二羰基化合物并富集大量AGEs。RAKETE S等[4]研究表明，在50℃老化2周的啤酒中乙二醛为4.98 μmol/L，甲基乙二醛为2.2 μmol/L，N-甲酰脯氨酸含量为3.08μmol/L，N-羧甲基脯氨酸为0.37μmol/L（乙二醛和甲基乙二醛为产生AGEs的中间体，N-甲酰脯氨酸和N-羧甲基脯氨酸为AGEs代表物）。目前，工业上主要采用二氧化硫抑制羰基化合物的形成，从而抑制AGEs，提高啤酒的抗老化能力，但二氧化硫带有刺激性气味，会影响啤酒的口感[5]。其他常见的AGEs抑制剂如氨基胍（aminoguanidine，AG）、二甲双胍、替尼司坦、维生素B6和肌肽等也都存在一定的副作用，如AG引起胃肠道功能紊乱、破坏肺功能以及引起血管炎等[6]。因此，寻找安全高效的天然AGEs抑制剂已成为本领域研究的热点。已有研究表明，白藜芦醇等类黄酮化合物对模拟生理条件下非酶糖化反应有较强的抑制作用[7]。

原花青素广泛存在于植物界，是目前国际上公认的最有效的天然抗氧化剂，具有很强的生物学活性，如降血糖、抗癌、抗衰老和预防心血管疾病等。原花青素具有较强的抗氧化活性，因此对AGEs具有潜在的抑制作用。自然界中的原花青素由不同数量的（+）-儿茶素（catechin，CC）、（-）-表儿茶素（epicatechin，EC）及其衍生物结合而成，因单体连接方式的不同，可分为A-型（C2-O-C7或C2-O-C5连接）和B-型（C4-C8或C4-C6连接）两种[8]。由于聚合度、缩合键位以及聚合物立体构象不同，原花青素的抗氧化活性各不相同。大多数实验都是基于模拟体系进行的研究，然而，在真实食品体系中对原花青素抑制AGEs的报道甚少，本研究对此进行了初探，利用啤酒老化体系来研究不同构象原花青素单体对啤酒老化过程中产生AGEs的抑制作用，这对于保障啤酒销售过程中的安全和消费者的健康至关重要，从而进一步促进了我国啤酒产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒（清爽8度330 mL听装）：华润雪花啤酒（中国）投资有限公司；儿茶素、表儿茶素、甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、三氟乙酸（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；氨基胍盐酸盐：上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）：上海源叶生物科技有限公司；碳酸氢钠、福林酚、考马斯亮蓝G-250、磷酸（85%）、乙醇、葡萄糖、麦芽糖、磷酸二氢钠、没食子酸：中国医药集团总公司；叠氮钠：天津市福晨化学试剂厂；羧甲基赖氨酸（纯度98%）：加拿大TRC公司。实验所用试剂无特殊说明，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME55电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CT15RE离心机：日本日立公司；XW-80A微型涡旋混合仪：上海泸西分析仪器厂有限公司；UV-1601紫外可分光光度计：北京瑞丽分析仪器有限公司；SB-5200DT超声波清洗剂：宁波新芝生物科技股份有限公司；RF5301荧光分光光度计：日本岛津公司；TSQ ENDURA高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）联用仪：美国Thermo公司；RE-111旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的配制

750 mL啤酒经超声波清洗仪除去气泡后，加入0.146 g叠氮钠（3 mmol/L，抑菌剂）。准确称取0.025 g的CC或EC，用超声后的啤酒分别定容至50mL，作为CC或EC母液，质量浓度为0.50mg/mL。将母液用啤酒稀释成不同质量浓度的反应液，最后使反应液中CC或EC质量浓度分别为0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL、0.20 mg/mL和 0.30 mg/mL，反应液总体积为5 mL。本实验用加入相同浓度AG的反应液作为阳性对照组，不加原花青素不加热反应液作为空白组，不加原花青素反应液作为对照组，每组设置3个平行。将反应液分别装入10 mL带盖玻璃瓶中，在50℃培养箱分别避光孵育，分别于2 d和5 d进行检测。

1.3.2 儿茶素及表儿茶素对啤酒老化过程中荧光性AGEs生成的抑制效果

取0.4 mL反应液需迅速置于冰水浴中，以防止反应继续进行，再加入相应pH（pH 4.5）的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（以防止荧光猝灭效应）稀释20倍。稀释后的反应液用荧光分光光度计（激发波长为370nm，发射波长为440nm，入射和出射狭缝宽度为5nm，电压为700V）测定其荧光吸收强度。用上述方法测得的荧光强度，取平均值后用以下公式对抑制率进行计算：式中：F样品为加入原花青素且加热反应液稀释后的荧光强度；F对照为不加原花青素且加热反应液稀释后的荧光强度；F空白为不加原花青素且不加热反应液稀释后的荧光强度。

1.3.3 儿茶素及表儿茶素对老化啤酒中蛋白含量的影响

采用李志江[9]的方法，进行适当的修改。取25℃、6 000 r/min条件下离心15 min的上清液，加入5 mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合均匀，放置2～3 min，用紫外分光光度计在波长595 nm处进行比色。

1.3.4 儿茶素及表儿茶素对老化啤酒中总酚含量的影响

采用赵晓娟等[10]的方法，进行适当的修改。取0.05 mL离心后反应上清液于带塞试管中，加入0.45 mL pH 4.5的PBS，将其稀释10倍后加入2.5 mL 10%福林酚溶液，充分混匀，再依次加入1 mL 15%碳酸钠溶液和1 mL蒸馏水，混匀后避光反应1h。反应液用紫外分光光度计在波长760nm处进行比色，参比溶液将1mL样品替换成1mLpH4.5的PBS。

1.3.5 儿茶素及表儿茶素对老化啤酒色度的影响

将离心后反应上清液注入10 mm玻璃比色皿中，以蒸馏水为空白调零，在波长为430 nm处测量其吸光度值，换算成EBC色度公式[11]如下：

色度（EBC）=10×1.27×A430nm-1.2

1.3.6 儿茶素及表儿茶素对啤酒老化过程中CML生成的HPLC-MS/MS分析检测[12-14]

称取1.0 mg标准品，置100 mL棕色容量瓶中，用去离子水配制成10 μg/mL的标准储备液，于4℃下保存。检测时用去离子水稀释标准溶液，配制成不同质量浓度的CML标准工作液。通过逐级稀释得到不同质量浓度的标样溶液，CML标样质量浓度分别为：0.01 μg/mL，0.05 μg/mL，0.10μg/mL，0.25μg/mL、0.50μg/mL。过水相滤膜，待HPLCMS/MS分析检测。

取0.5 mL反应液加入0.5 mL硼氢化钠溶液（0.2 mol/L，pH 13～14）还原，得到乳浊剂，样品在4℃还原10 h后，在4℃、15000r/min条件下离心60min，收集上清液。取0.5mL上清液通过预活化后的PCX固相萃取柱（预活化条件：依次3 mL蒸馏水和3 mL蒸馏水冲洗柱芯），再依次用3 mL蒸馏水3 mL甲醇冲洗。用甲醇（含5%氨水）洗脱出目标化合物，旋转蒸发仪除去甲醇后复溶于2 mL 0.1%的甲酸水溶液中，分析前通过0.22 μm有机系滤膜过滤，待HPLC-MS/MS分析检测。

高效液相色谱条件：流动相A为0.02%三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，进样量10 μL，流速为0.2 mL/min，柱温30℃，梯度洗脱条件为0～0.5 min为90%A，0.5～4.0 min为90%～60%A，运行时间为14 min。

质谱条件：正离子电喷雾离子化（electrospray ionizaion，ESI+）；离子源温度为300 ℃；毛细管电压为4 kV；一级质谱四级杆温度和二级质谱四级杆温度均为100℃；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式的设置为m/z205.0→m/z84.22，m/z205.0→m/z130.11。

1.3.7 分子对接

在ZINC数据库（http：//zinc.docking.org）中下载儿茶素和表儿茶素的分子结构模型（ID：119983和119988）。CML的晶体结构由Sybyl 2.1.1软件画出。再用Tripos力场和Gasteiger-Huckell电荷优化分子的几何结构。用Sybyl 2.1.1软件对CML分别与儿茶素和表儿茶素进行了分子对接。在对接过程中，考虑了化合物的20个构象，取对接打分最高的进行进一步分析。

1.3.8 统计数学分析

采用SPSS v21.0软件进行相关性和显著性分析，所有样品进行3次测定（n=3），结果用平均值±标准偏差（X±SD）表示，两组数据间显著性差异表示为P＜0.05。绘图通过OriginPro 8.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 儿茶素及表儿茶素对啤酒老化过程中荧光性AGEs生成的抑制效果

不同原花青素低聚体对啤酒老化产生AGEs抑制效果如图1所示，CC、EC及AG对AGEs的抑制效果随着质量浓度的增大而增大，呈剂量依赖性且有显著性影响（P＜0.05）。老化2 d抑制率达到最大，CC可达到（62.27±2.80）%，EC可达到（54.99±0.441）%。由图1A可知，老化2 d后，CC对老化啤酒中AGEs的生成的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为（0.211±0.015）mg/mL，EC的IC50为（0.270±0.022）mg/mL，AG的IC50为（0.497±0.009）mg/mL。由图1B可知，CC对啤酒中AGEs的生成的IC50为（0.289±0.008）mg/mL，EC的IC50为（0.329±0.018）mg/mL，AG的IC50为（0.552±0.010）mg/mL。结果表明，在啤酒分别老化2 d和5 d后，CC及EC比阳性对照AG抑制同期老化产生的AGEs的作用要强。并且，CC的抑制作用比EC强。对于多酚类物质抑制AGEs机制，国外有研究报道[20]称，多酚类物质具有清除自由基的能力，抑制了AGEs形成的中间阶段，即多酚类物质捕获美拉德反应中间产物—Amadori产物（如α-二羰基化合物），从而阻止了AGEs的形成。

图1 不同含量的儿茶素及表儿茶素对啤酒老化2 d(A)及5 d(B)过程中AGEs生成的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of different concentrations of CC and EC on AGEs production during beer aging process for 2 d(A)and 5 d(B)

2.2 儿茶素及表儿茶素对老化啤酒中蛋白含量的影响

由表1可知，加入高浓度的原花青素老化啤酒的蛋白含量会稍大于加入低浓度原花青素的，是由于测量样品数较大，每个样品反应的时间有差异。反应时间过长，则染液蛋白复合物会形成可见的沉淀，吸光度值会降低，会影响实验的精确性[15]。随着啤酒的老化，美拉德反应的加剧，啤酒中的蛋白一部分成为糖化蛋白，一部分与多酚耦合形成絮状沉淀，但是总含量不变，因此不同浓度的原花青素对老化啤酒中蛋白的含量没有显著性影响（P＞0.05）。

表1 不同含量的儿茶素及表儿茶素对啤酒老化过程中蛋白含量的影响Table 1 Effects of different concentrations of CC and EC on protein contents during beer aging process

2.3 儿茶素及表儿茶素对老化啤酒中总酚含量的影响

表2 不同含量的儿茶素及表儿茶素对啤酒老化过程中总酚含量的影响Table 2 Effects of different concentrations of CC and EC on total phenols contents during beer aging process

大麦和酒花是啤酒中多酚的重要来源，其中80%左右来源于大麦，20%左右来源于酒花[16]。由表2可知，啤酒中本身含有的总酚含量为（0.211±0.001）mg/mL，随着添加的CC和EC质量浓度的增大，啤酒中总酚含量随之增大，且有显著性差异（P＜0.05）。添加量为0.30 mg/mL时，啤酒的总酚含量达到最大，第0、2、5天加入CC老化啤酒总酚含量最高分别可达（0.564±0.035）mg/mL、（0.558±0.024）mg/mL、（0.560±0.019）mg/mL。第0、2、5天加入EC老化啤酒总酚含量最高可达（0.561±0.021）mg/mL、（0.564±0.025）mg/mL、（0.556±0.006）mg/mL。

2.4 儿茶素及表儿茶素对老化啤酒色度的影响

由表3可知，随着啤酒的老化，不加抑制剂的啤酒色度由最初（0.756±0.034）EBC增加至（4.185±0.008）EBC，这是由于啤酒在老化过程中美拉德反应加剧，颜色加深。加入原花青素后，啤酒色度随抑制剂浓度的增大而增大，且有显著性变化（P＜0.05）。第5天时，加入了CC的老化啤酒，色度达到最大（6.534±0.007）EBC，是最初色度的1.5倍，因为其水溶液在加热条件下溶液通过缩合形成无定型鞣质，鞣质在溶液中容易被氧化，颜色变暗[17]，增加了啤酒的色度。而阳性对照AG添加量对啤酒色度无显著性影响（P＜0.05）。

表3 不同含量的儿茶素及表儿茶素对老化啤酒色度的影响Table 3 Effects of different concentrations of CC and EC on the chromaticity during beer aging process

2.5 儿茶素及表儿茶素对啤酒老化过程中CML生成的抑制

经计算得Nε-羧乙基赖氨酸标准曲线，回归方程为y=-211 445.3+3 782 080x，相关系数R2=0.999 7，CML的质谱图见图2。由图2可知，经二级质谱解析，得到定性和定量离子碎片m/z=84.2和130.1。由图3可知，随着原花青素质量浓度的增大，对CML抑制效果越好，且EC的抑制效果要好于CC的抑制效果。CC对其抑制率最大可达（8.67±0.23）%，EC对其抑制率最大可达（9.68%±0.83）%。

图2 应用HPLC-MS/MS法检测Nε-羧甲基赖氨酸的离子质谱图(A)及色谱图(B)Fig.2 Ion mass spectrogram(A)and chromatogram(B)for Nε-carboxy methyl lysine analysis by HPLC-MS/MS

图3 不同的儿茶素及表儿茶素对老化啤酒中Nε-羧甲基赖氨酸的抑制效果Fig.3 Inhibition effects of different concentrations of CC and EC on Nε-carboxy methyl lysine during beer aging process

2.6 分子对接

CC/EC与CML的分子对接结果如图4所示，经软件计算CML与CC对接打分为1.006 9，CML与EC对接打分为1.514 2，说明表儿茶素与CML结合时所需的自由能更低，更易与CML结合，以致EC抑制CML的效果比CC好。

图4 儿茶素及表儿茶素与Nε-羧甲基赖氨酸分子对接结果Fig.4 Molecular docking results between CC and Nε-carboxyethyl lysine,EC and Nε-carboxy methyl lysine

3 讨论

啤酒在长期储存的过程中会发生老化，不仅影响了啤酒的风味，同时会产生AGEs，危害人体的健康。原花青素是一种天然抗氧化剂，但作为食品添加剂的应用报道较少。WU Q等[18]研究发现，在模拟生理环境条件下，对低聚原花青素与AG的抑制效果进行了比较，相同质量浓度（1 mg/mL）时，低聚原花青素抑制率为（111.26±0.43）%，AG抑制率为（57.20±1.96）%，低聚原花青素的抑制效果明显高于AG。

综合上述实验结果可得，在模拟啤酒老化过程中，加入原花青素对老化过程中产生荧光性AGEs的作用呈剂量依赖性，且在老化第2天和第4天后，原花青素的抑制效果都要比AG好，并且儿茶素的抑制效果要稍好于表儿茶素的效果。在YOKOZAWA T等[19]的研究中得到了相似的结果，CC和EC抑制BSA-葡萄糖（果糖）反应体系中的荧光性AGEs的能力高于AG（pH7.4，37℃孵育14 d），并且CC的抑制效果要好于EC。说明原花青素是代替AG的良好天然AGEs抑制剂。本实验对原花青素对啤酒非生物稳定性作出探讨，在老化过程中，原花青素对啤酒蛋白含量无显著影响，对啤酒总酚含量呈剂量依赖性，原花青素含量越高啤酒颜色越深。用分子对接阐述了CC和EC对与CML的结合情况，结果得出，EC抑制CML的效果比儿茶素强是由于在与CML结合时所需的自由能更低。本实验研究了原花青素抑制啤酒老化过程中产生的AGEs，为原花青素作为食品添加剂提供了新思路，同时也可以提高对天然产物的开发和利用。

4 结论

本实验探究了原花青素抑制啤酒老化过程中产生AGEs的情况，不同浓度的原花青素加入啤酒中，老化2 d和5d后，对啤酒中荧光性AGEs抑制效果CC＞EC＞AG。对啤酒蛋白含量无显著影响（P＞0.05），对啤酒总酚和色度有显著性影响（P＜0.05），且呈剂量依赖性。对CML的抑制效果为EC＞CC。

[1]SARAH N,MIRELA P,LUCIAN G.Early glycation products of endothelialplasma membrane proteins in experimental diabetes[J].Biochimica Biophysica Acta Biomembr,2006,1762(1):94-102.

[2]ROJAS A,MORALES M A.Advanced glycation and endothelial functions:A link towards vascular complications in diabetes[J].Life Sci,2004,76(7):715-730.

[3]GRILLO M A,COLOMBATTO S.Advanced glycation end-products(AGEs):involvement in aging and in neurodegenerative diseases[J].Amino Acid,2008,35(1):29-36.

[4]RAKETE S,KLAUS A,GLOMB M A.Investigations on the Maillard reaction of dextrins during aging of Pilsner type beer[J].J Agric Food Chem,2014,62(40):9876-9884.

[5]林智平，冯景章，顾国贤.提高麦汁还原力对啤酒风味稳定性的影响[J].食品与发酵工业，2003，29（11）：51-54.

[6]GRZEBYK E,PIWOWAR A.Inhibitory actions of selected natural substances on formation of advanced glycation end products and advanced oxidation protein products[J].BMC Complem Altern Med,2016,16(1):381-390.

[7]SHEN Y X,XU Z M,SHENG Z W.Ability of resveratrol to inhibit advanced glycation end product formation and carbohydrate-hydrolyzing enzyme activity,and to conjugate methylglyoxal[J].Food Chem,2017,216(1):153-160.

[8]AMBIGAIPALAN P,DE CAMARGO A C,SHAHIDI F.Phenolic compounds of pomegranate byproducts(outer skin,mesocarp,divider membrane)and their antioxidant activities[J].J Agric Food Chem,2016,64(34):6584-6604.

[9]李志江.考马斯亮蓝G250染色法测定啤酒中蛋白质含量[J].酿酒，2008，35（1）：70-72.

[10]赵晓娟，李敏仪，黄桂颖，等.Folin-Ciocalteu法测定苹果醋饮料的总多酚含量[J].食品科学，2013，34（8）：31-35.

[11]董小雷，崔云前，周广田.啤酒分析检测技术[M].北京：化学工业出 版社，2008：140-143.

[12]WU Q,LI S,FU X,et al.Spectroscopic studies on binding of lotus seedpod oligomeric procyanidins to bovine serum albumin[J].J Appl Spectrosc,2014,80(6):884-892.

[13]ASSAR S H,MOLONEY C,LIMA M,et al.Determination of Nepsilon-(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[J].Amino Acids,2009,36(2):317-326.

[14]YOON S R,SHIM S M.Inhibitory effect of polyphenols inHouttuynia cordata on advanced glycation end products(AGEs)by trapping methylglyoxal[J].LWT-Food Sci Technol,2015,61(1):158-163.

[15]杜 芳.啤酒泡沫蛋白的分离鉴定及啤酒生产中硅胶应用的研究[D].济南：齐鲁工业大学，2013.

[16]王志坚.啤酒中的多酚物质[J].食品工业，2003（4）：16-18.

[17]徐 勤.鞣质的研究进展[J].华夏医学，2004，17（1）：113-115.

[18]WU Q,CHEN H,LV Z,et al.Oligomeric procyanidins of lotus seedpod inhibits the formation of advanced glycation end-products by scavenging reactive carbonyls[J].Food Chem,2013,138(2):1493-1502.

[19]YOKOZAWA T,NAKAGAWA T.Inhibitory effects of Luobuma tea and its components against glucose-mediated protein damage[J].Food Chem Toxicol,2004,42(6):975-981

[20]WU J W,HSIEH C L,WANG H Y,et al.Inhibitory effects of guava(Psidium guajavaL.)leaf ex-tracts and its active compounds on the glycation process of protein[J].Food Chem,2009,113(1):78-84.