阿特拉津高灵敏酶联免疫吸附检测法的建立*

李晓丽，王婷婷，刘 凯，宁保安，马新华，刘 楠，欧国荣，高志贤，刘忠文

（军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室天津300050）

阿特拉津，又名莠去津（atrazine，AT），化学名称为：2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-l，3，5-三嗪，作为一种除草剂在世界范围内已广泛推广应用了40多年，环境中有着广泛的分布。经调查，我国某些地区的河流、水库、土壤中均发现有阿特拉津农药残留［1］。

阿特拉津残留的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法和传感器检测法等［2，3］。上述方法需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员，不适宜现场的快速检测。酶联免疫吸附法（ELISA）是目前发展最为迅速且较为完善的检测方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、检测费用低、用时少等特点，因此应用范围极为广泛。本实验室建立的检测克伦特罗的ELISA，灵敏度高、特异性好［4］；闫莉等建立的双抗体夹心ELISA能够方便、准确、快速地检测组织中的3-硝基酪氨酸含量［5］。基于此，本研究拟建立检测阿特拉津的间接竞争ELISA。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、吐温-20、过氧化氢、尿素均为美国Sigma公司产品，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体购自北京中杉金桥生物公司；四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）购自天津华生生物技术有限公司。其他未作特别说明的试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器及材料

酶联条（天津润泰科技有限公司）；MultiskanMK3酶标仪（Thermo Labsystems公司）；微量移液器（Eppendorf）；ALC-210型 4万分之一电子天平（AcculAB）；Alliance 2695型 HPLC仪（美国 Waters公司）；电热恒温培养箱（天津市实验仪器厂）；其它未作说明的仪器均为实验室常规国产仪器。

1.3 间接竞争 ELISA［6］

具体操作见参考文献6。简要修改如下：用包被缓冲液（pH9.6，0.05 mol／L的 CBS）将包被抗原稀释成适当浓度，加入96孔板，每孔100μl，37℃温育2 h。用 pH 7.4的 PBST洗涤液洗涤 3次，每次 3 min，每次洗涤后甩去孔中洗涤液，在吸水纸上拍干。每孔加入130μl封闭溶液，37℃温育1 h，用PBST洗涤3次，每次3min。用样品稀释液将竞争抗原稀释成一定浓度，每孔加入50μl一系列浓度的竞争抗原；用抗体稀释液将一抗稀释成一定浓度，每孔加入50μl适当浓度的一抗，37℃温育 1.5 h，用 PBST洗涤5次，每次3 min。每孔加入100μl新配制的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG，37℃温育45 min，用PBST洗涤6次，每次3 min。每孔加入新配制的底物液100μl，37℃温育10 min，然后每孔加入2mol／L的H2SO4溶液 50μl终止反应，在酶联免疫检测仪上读取A450nm和A630nm。

1.4 ELISA法条件优化［7］

1.4.1 包被抗原与一抗的最佳工作浓度筛选 采用棋盘滴定法来确定两者的最佳结合浓度。首先用一系列浓度的包被抗原包被96孔酶标板，再将一抗作一系列稀释，用间接ELISA测定两者的最佳结合浓度，操作步骤同1.3。

1.4.2 选择一抗稀释度为1∶16 000对包被抗原进行细化筛选实验 操作步骤同1.3所示。实验将包被抗原的浓度分别调整为 1，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2μg／ml，纵向包被 96孔板，每孔加入包被抗原100μl，4℃过夜。用PBS按5倍的梯度稀释竞争抗原，浓度从 20μg／ml至 5×10-5μg／ml，共 9个梯度，在96孔板中每孔加入50μl。将一抗的浓度调整为1∶16 000，每孔加入 50μl。其他操作步骤不变，取A450nm值最接近于1、且IC50值最小的包被抗原浓度为最佳工作浓度。

1.4.3 不同有机溶剂对竞争结合反应的影响 用含不同浓度的不同有机溶剂来稀释农药标样，其中有机溶剂用0.1 mol／L的 PBS稀释，在已优化条件的基础上，进行间接竞争ELISA测定，考察不同浓度的不同有机溶剂对抗原抗体竞争结合反应的影响。最终选择影响最小的有机溶剂及其浓度作为最佳有机溶剂及浓度。

1.4.4 酶标二抗稀释度筛选 将酶标二抗即辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的浓度按1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶3 500，1∶4 000，1∶4 500，1∶5 000的稀释度等差稀释，然后进行间接竞争ELISA实验，绘制标准曲线，并计算各稀释度下阿特拉津检测的IC50值，选择IC50值较小、特异性吸附较小、且A450nm值在1附近的二抗浓度作为最佳酶标二抗稀释度。

1.5 检测阿特拉津间接竞争ELISA标准曲线的建立［8］

1.5.1 标准曲线的绘制 在线性范围内，用样品稀释液（PBS，含10%甲醇）将阿特拉津标样稀释成如下的一系列浓度：123.46 ng／ml，41.15 ng／ml，13.72 ng／ml，4.57 ng／ml，1.52ng／ml，0 ng／ml，共 6个梯度。用以上优化的最佳条件，按间接竞争ELISA进行阿特拉津检测，每个浓度重复测定5次，以阿特拉津浓度的对数值为横坐标，以各浓度对应的抑制率为纵坐标绘制工作曲线，并对工作曲线进行方程拟合，计算工作曲线的拟合度，建立阿特拉津检测的标准曲线，同时依据该标准曲线得出最低检出限及线性范围。

1.5.2 间接竞争ELISA特异性实验 按照以上优化的最优条件，以间接竞争ELISA测定阿特拉津的A450nm值。同时，按相同的稀释方法稀释阿特拉津的结构类似物及功能类似物扑草净，扑灭津，特丁通，三聚氰胺，毒死蜱，久效磷，对硫磷，六六六，并采用同一抗体进行间接竞争 ELISA，测定各类似物的A450nm值，绘制标准曲线，计算抑制率等于50%时所需抑制物的浓度IC50，计算交叉反应率，交叉反应率越低，方法的特异性越好。

1.5.3 样品添加回收率实验［9］白菜、番茄、胡萝卜、梨、甘蔗、瘦肉均购自某菜市场，自来水采自天津自来水厂，牛奶购自某超市。每种样品分别取四组，按常规前处理方法处理后，再按上述摸索优化的最佳条件进行间接竞争ELISA测定。其中，每块酶标板均设置标准曲线，且每个标样浓度重复测定5次，各样品的每个浓度也重复测定5次，计算与样品各浓度对应的抑制率，并与同一块酶标板的标准曲线对照，计算农药含量和样品添加回收率。将测得的添加回收率进行统计，计算回收率变异系数和回收率的变化范围，要求添加回收率落在相对稳定、狭窄的区间内。

1.5.4 ELISA与仪器方法的比对实验 在本实验ELISA检测的线性范围内，随机选取番茄和梨作为样本与高效液相色谱法（HPLC）进行比对实验。番茄和梨两种样品中阿特拉津标样的添加浓度为0 ng／ml，6 ng／ml，30 ng／ml，80 ng／ml。样品按常规方法进行前处理。

2 结果

2.1 包被抗原与一抗最佳工作浓度筛选

采用棋盘滴定法筛选包被抗原和一抗的最佳结合浓度。由表1可知：当包被原浓度为1.6μg／ml、一抗的浓度为1∶16 000时，对应的A450nm值为1.049，此时检测灵敏度较高。初步选定包被抗原的工作浓度为 1.6μg／ml，一抗的工作浓度为 1∶16 000。

Tab.1 The selection of the optimum working concentration of coating antigen and antibody

2.2 选择一抗稀释度为1∶16 000对包被抗原进行细化筛选试验

为了进一步确定包被抗原的量，本实验围绕包被抗原的较适工作浓度（1μg／ml～2.2μg／ml），以前一实验筛选的一抗工作浓度（1∶16 000）进行间接竞争ELISA测定，其中阿特拉津小分子的使用浓度为20μg／ml～5×10-5μg／ml（按 5倍的梯度稀释），共 9个梯度。选择A450nm值在1附近且检测灵敏度较高时所对应的包被抗原浓度为最佳浓度（表2）。

Tab.2 The selection experimentof the optimum working concentration of coating antigen

由表2可知：当包被抗原的浓度为1.6μg／ml时，其 A450nm值在 1附近（1.086），且 IC50值最小（4.679），因此选择包被抗原浓度 1.6μg／ml。

2.3 不同有机溶剂对竞争结合反应的影响

由图1可知：各有机溶剂对ELISA竞争结合反应均有一定的影响，表现在A450nm值均有不同程度的降低。而且同一种有机溶剂的浓度越大，对竞争结合反应的抑制作用也越大。在所检测的几种有机溶剂中，对竞争结合反应影响最小的是甲醇，曲线相对平缓。当甲醇浓度为5%和10%时，对竞争结合反应的影响较小。

由图2可知：当甲醇浓度为10%时，其对应的IC50值和LOD值均最小，即灵敏度最高，因此本研究最终选择10%甲醇作为助溶剂。

Fig.1 Effects of different solvents on competitive binding reaction MeOH：Methanol；ACN：Acetonitrile；PA：Acetone；DMF：N，N-dimethylformamide

Fig.2 The value of IC50 and LODwith differentmethanol concentrationLOD：Theminimum detection limit

2.4 酶标二抗稀释度的筛选

在本研究中，将酶标二抗的浓度按1∶1 500，1∶2 000，1∶2 500，1∶3 000，1∶3 500，1∶4 000，1∶4 500，1∶5 000的稀释度等差稀释后，在已优化条件的基础上进行间接竞争ELISA实验，结果如表3。

Tab.3 The selection experiment of the optimum concentration of goat anti-mouse IgG-HRP

由表3可知：当辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG的稀释度为1∶4 000时，其检测灵敏度及线性关系是最好的，因此选择稀释度为1∶4 000作为酶标二抗的最佳稀释度。

2.5 标准曲线的绘制

本研究在线性范围内，将阿特拉津标样用样品稀释液（PBS，含 10%甲醇）稀释成一系列浓度（123.46 ng／ml，41.15 ng／ml，13.72 ng／ml，4.57 ng／ml，1.52 ng／ml，0 ng／ml），在已优化条件的基础上进行间接竞争ELISA检测，每个浓度重复测定5次，以阿特拉津浓度的对数值为横坐标，以各浓度对应的抑制率为纵坐标绘制工作曲线，结果如下。

Fig.3 Repeatability of standard curve for detecting AT

由图3可知：标准曲线的重复性很好，几乎重叠，表明方法的重复性很好。由5个重复的平均值所做的标准曲线呈“S”形，其头及尾部曲线趋于平坦，中央近似直线的部分是最理想的检测区域。对此检测区域进行拟合，拟合图见图4。

Fig.4 Standard curve for detecting AT

2.6 方法特异性实验

Tab.4The specificity of ELISA

T e r b u m e t o n 3.0 5 0 E+1 7 ＜0.0 1%M e l a m i n e 5.5 9 8 E+4 8 3＜0.0 1%C h l o r p y r i f o s 1.2 7 0 E+4 3 ＜0.0 1%M o n o c-r o t o p h o s 3.2 0 0 E+1 8 ＜0.0 1%P a r a t h i o n 7.3 9 0 E+0 8 ＜0.0 1%H e x a c h l o r o-c y c l o h e x a n e 2.4 8 0 E+9 5 ＜0.0 1%

2.7 样品回收率实验结果

从表6可以看出：当添加阿特拉津浓度为0 ng／ml和6 ng／ml时，ELISA检测梨中阿特拉津残留量分别为 1.356ng／ml和 7.826ng／ml，回收率为107.80%；番茄中阿特拉津残留量分别为1.552 ng／ml和6.969 ng／ml，回收率为 90.28%；而在此浓度范围内 HPLC均未检出。

另还可知：当阿特拉津添加浓度为30 ng／ml及80 ng／ml时，ELISA检测梨中阿特拉津残留的回收率分别为89.01%和91.87%，番茄中阿特拉津残留的回收率分别为88.16%和 89.00%；HPLC法检测梨中阿特拉津残留的回收率分别为 126.7%和88.48%，番茄中分别为 121.0%和 93.41%。

3 讨论

本研究建立的检测阿特拉津ELISA的标准曲线的重复性很好，曲线相关系数R2＝0.9958，提示相关性较好，标准曲线最低检出限为1.972 ng／ml。从采用阿特拉津结构类似物进行的交叉反应结果可以看出，除扑草净和扑灭津外，其他类似物与阿特拉津的交叉反应率均远低于0.01%，说明该方法特异性较好。扑草净，扑灭津与阿特拉津的相似之处，是其化学结构中均有三嗪母环及环上的一个亚氨基（-NH-）和一个异丙氨基，交叉反应率高达285%～380%，提示抗阿特拉津抗体是针对三嗪母环及环上的亚氨基和异丙氨基的。

Tab.5 Recoveries of different samples（n＝5）

Tab.6 The comparition between ELISA and HPLC（n＝5）

通过与HPLC对比试验，证实本文建立的阿特拉津ELISA检测与HPLC检测具有较好的可比性，说明此方法可代替大型仪器用于阿特拉津的检测。

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