育阴软肝颗粒剂对肝纤维化大鼠TGF-β1表达的影响*

王志旺，付晓艳，程小丽，包小英，刘雪枫，段海婧

（1.甘肃中医药大学，兰州730000；2.甘肃中医药大学附属医院，兰州730000）

中医理论认为肝在生理上“体阴而用阳”［1］，在病理上“阳常有余阴常不足”［2］，故“体阴而阴常不足”是肝病的基本病机。育阴软肝颗粒剂是在上述中医病机的基础上，在育阴软肝治法的指导下由山茱萸、牡丹皮、柴胡、白芍、鳖甲等中药制成的颗粒剂，具有育阴软肝、化瘀散结、柔肝健脾的功效，临床上对慢性肝炎、特别是肝纤维化有明显疗效。肝纤维化是肝病过程中肝细胞外纤维组织异常增生的过程，而转化生长因子β1（TGF-β1）是促纤维化关键因子之一［3］。本实验在复制肝纤维化大鼠模型的基础上，通过育阴软肝颗粒剂的干预，从肝功能、肝纤维化相关指标及肝组织TGF-β1表达等方面探讨育阴软肝颗粒剂防治肝纤维化的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

育阴软肝方颗粒剂，甘肃中医药大学药理学教研室，批号：20151108；秋水仙碱（colchicine），西双版纳版纳药业责任有限公司，国药准字H53021369，批号：20160204；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒购自南京建成生工研究所；透明质酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前胶原（Ⅲ procollagen，PCⅢ）、Ⅳ型胶原（type IV collagen，C-Ⅳ）、板层素（laminin，LN）及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）ELISA试剂盒购自北京北方生物技术研究所；TGF-β1抗体试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器

BS1103型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），TGL-16G型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），722型分光光度计（上海第三分析仪器厂），CH-212型光学显微镜（Olympus），BI-2000型医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 动物

SPF级Wistar大鼠60只，体重190～230 g，雌雄各半，甘肃中医药大学实验动物中心提供并进行实验，实验动物质量合格证No.62001000000241，实验动物设施使用合格证No.00000269。

1.4 分组、造模与给药

Wistar大鼠（♂♀各半）在SPF级实验室正常饲养1周后随机分成6组（n＝10），即对照组、模型组、秋水仙碱组（0.1mg／kg）以及育阴软肝颗粒剂（Yuyin Ruangan Granule，YRG）高（24.8 g／kg）、中（12.4 g／kg）、低（6.2 g／kg）剂量组。参考文献［4］及预实验结果，采用多因素复制大鼠肝纤维化造模，即背部皮下注射40%四氯化碳橄榄油，2次／周，第一次剂量5.0 ml／kg，以后各次均为 3.0ml／kg，持续6周；同时给予高脂饲料（猪油 20%+胆固醇 0.5%+玉米粉79.5%）并饮用20%乙醇。空白对照组皮下注射等体积橄榄油，正常饲养。秋水仙碱组及育阴软肝颗粒剂组从造模开始即按上述剂量灌胃给药，对照组和模型组给予纯净水15ml／kg灌胃，每日一次，连续给药6周。

1.5 指标观测及方法

实验过程中观测大鼠精神状态、毛色、体重、进食及饮水量等一般情况。实验第43天，经戊巴比妥钠麻醉后，股静脉取血，分离血清测定 ALT、AST、HA、PCⅢ、CⅣ、LN、TGF-β1水平。手术摘取大鼠肝脏，称重，计算肝指数（肝重mg／体重 g）。在固定位置取肝组织，经固定、切片、HE染色，观测其病理学变化，依文献方法［5］在镜下进行半定量分析；另取肝组织切片，经免疫组化染色，观测TGF-β1表达变化。

1.6 统计分析

实验数据以均值 ±标准差（）表示，应用SPSS 11.5统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析法。

2 结果

2.1 育阴软肝颗粒剂对肝纤维化大鼠肝指数及血清ALT、AST活性的影响

采用多因素复制肝纤维化模型6周后，模型组大鼠肝指数及血清ALT、AST活性显著升高，与对照组比较有统计学意义（P＜0.01，表1）。经育阴软肝颗粒剂处理后，肝指数及血清ALT、AST活性明显下降，与模型组比较有统计学意义（P＜0.01）。但同时发现，育阴软肝颗粒剂降低血清ALT、AST的作用弱于秋水仙碱，部分剂量组与秋水仙碱组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.1 Effects of YRG on liver index and ALT，AST activity in serum of the liver fibrosis rats（，n＝10）

Tab.1 Effects of YRG on liver index and ALT，AST activity in serum of the liver fibrosis rats（，n＝10）

YRG：Yuyin Ruangan Granule；ALT：Alanine aminotransferase；AST：Aspartate aminotransferase**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Colchicine group

Group Liver index（mg／g） ALT（U／L） AST（U／L）Control 28.3±3.8 59.82±8.49 232.18±22.61 Model 43.2±7.4** 147.82±30.05** 422.17±41.34**Colchicine 36.6±5.5**＃ 89.17±13.01**＃＃ 279.04±27.25**＃＃YRG（24.8 g／kg） 33.0±5.8*＃＃ 93.58±15.73**＃＃ 308.70±34.90**＃＃△YRG（12.4 g／kg） 33.9±5.6*＃＃ 101.24±17.03**＃＃ 329.09±37.81**＃＃△△YRG（6.2 g／kg） 35.4±4.0**＃＃ 112.54±19.10**＃＃△△ 342.69±39.30**＃＃△△

2.2 育阴软肝颗粒剂对肝纤维化大鼠血清肝纤维化相关指标的影响

肝纤维化大鼠血清透明质酸（HA）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（C-Ⅳ）及板层素（LN）含量显著升高，与对照组比较有统计学意义（P＜0.01，表 2）。在育阴软肝颗粒剂的干预下，血清 HA、PCⅢ、C-Ⅳ及LN含量明显下降，与模型组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。但同时发现，育阴软肝颗粒剂降低血清PC-Ⅲ、LN的作用弱于秋水仙碱，部分剂量组与秋水仙碱组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.2 Effects of YRG on correlative indicators in serum of the liver fibrosis rats（，n＝10）

Tab.2 Effects of YRG on correlative indicators in serum of the liver fibrosis rats（，n＝10）

YRG：Yuyin Ruangan Granule；HA：Hyaluronic acid；PCⅢ：Ⅲ procollagen；C-Ⅳ：TypeⅣ collagen；LN：Laminin**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Colchicine group

Group HA（μg／L））Control 72.83±14.46 50.56±7.78 52.67±11.63 80.44±10.54 Model 141.94±23.68** 94.66±14.44** 85.39±16.64** 150.71±18.57**Colchicine 88.60±18.22*＃＃ 64.36±8.70**＃＃ 60.52±13.08＃＃ 102.00±14.81**＃＃YRG（24.8 g／kg） 92.65±18.77*＃＃ 71.49±9.52**＃＃ 59.36±11.87＃＃ 101.48±15.63**＃＃YRG（12.4 g／kg） 95.52±20.55*＃＃ 75.79±10.58**＃＃△ 64.97±14.38*＃＃ 113.98±15.57**＃＃YRG（6.2 g／kg） 103.04±21.14**＃＃ 76.42±11.01**＃＃△ 66.07±15.85*＃ 122.51±16.83**＃＃PC-Ⅲ（μg／L）C-Ⅳ（μg／L）LN（μg／L△△

2.3 育阴软肝颗粒剂对大鼠纤维化肝组织病理学的影响

对照组大鼠肝脏呈紫红色，表面光滑均匀。模型组大鼠肝脏呈暗紫红色，表面有浅黄色颗粒。与模型组比较，育阴软肝颗粒剂各剂量组大鼠肝脏有不同程度的好转。在光镜下（图1），对照组大鼠肝细胞排列规整，肝小叶结构完整（图1a）；模型组大鼠肝细胞排列紊乱，肝小叶结构破坏且其间有大量胶原蛋白沉积（图1b）；育阴软肝颗粒剂各剂量组大鼠肝组织的上述病理变化有不同程度的缓解（图1d、1e、1f）。半定量分析结果显示，模型组大鼠肝组织纤维化程度明显加重，与对照组比较有统计学意义（P＜0.01，表3）；在育阴软肝颗粒剂的干预下，大鼠肝纤维化程度有不同程度缓解，与模型组比较有统计学意义（P＜0.01）。但同时发现，育阴软肝颗粒剂抑制肝纤维化的作用弱于秋水仙碱，低剂量组与秋水仙碱组比较有统计学意义（P＜0.05）。

Fig.1 Effects of YRG on hepatic histopathology of the liver fibrosis rats（HE staining×20）

2.4 育阴软肝颗粒剂对肝纤维化大鼠血清及肝组织TGF-β1表达的影响

由表4可见，肝纤维化大鼠血清TGF-β1含量显著升高，与对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；经育阴软肝颗粒剂干预后，血清TGF-β1含量明显下降，与模型组比较有统计学意义。如图2所示，镜下观察大鼠肝组织TGF-β1免疫组化染色呈灰黑色颗粒状，主要分布于细胞质内。空白组大鼠肝组织中TGF-β1表达甚少，仅在门静脉周围及小叶中央静脉周围有少量表达（图2a）；模型组大鼠TGF-β1广泛表达于肝组织汇管区周围细胞、窦壁细胞及部分肝细胞，轮廓清楚，着色较深（图2b）；育阴软肝颗粒剂各剂量组大鼠肝组织TGF-β1的表达强度较模型组不同程度的减弱，多见于汇管区及纤维间隔内，呈弱阳性着色（图 1d、1e、1f）。对 TGF-β1进行半定量分析的结果显示，模型组大鼠肝组织TGF-β1表达的平均吸光度值显著升高，与正常组比较有统计学意义（P＜0.01，表 3），而育阴软肝颗粒剂各剂量组 TGF-β1表达的平均吸光度值呈现不同程度缓解，与模型组比较有统计学意义（P＜0.01）。但同时发现，育阴软肝颗粒剂抑制TGF-β1表达的作用弱于秋水仙碱，部分剂量组与秋水仙碱组比较有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.2 Effectsof YRG on TGF-β1 expression in fibrotic liver tissue（×40）

Tab.3 Effects of YRG on hepatic histopathology and TGF-β1 expression in fibrotic liver tissue（，n＝10）

Tab.3 Effects of YRG on hepatic histopathology and TGF-β1 expression in fibrotic liver tissue（，n＝10）

YRG：Yuyin Ruangan Granule；TGF-β1：Transforming growth factor-β1**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs Colchicine group

Group Scoring of liver fibers（score））TGF-β1 in liver tissue（average value of photodensity Control 1.10±0.52 13.69±1.54 0.240±0.020 Model 4.85±1.13** 22.80±2.63** 0.372±0.037**Colchicine 2.45±0.90**＃＃ 16.24±1.89**＃＃ 0.266±0.021*＃＃YRG（24.8 g／kg） 2.60±0.94**＃＃ 17.50±2.12**＃＃ 0.282±0.024**＃＃YRG（12.4 g／kg） 3.00±0.97**＃＃ 18.15±2.22**＃＃ 0.305±0.027**＃＃△△YRG（6.2 g／kg） 3.40±1.10**＃＃△ 19.08±2.49＃＃△ 0.334±0.028**＃TGF-β1 in serum（μg／L）△△

3 讨论

肝纤维化是多种肝病过程中肝组织对慢性损伤的修复反应，也是肝病治疗的难点之一。研究发现，肝组织纤维化与抗纤维化处于动态平衡之中，在药物干预下肝纤维化可以逆转，因此使用药物防治肝纤维化是肝病治疗的重要环节［6］。在“体阴而用阳”与“阳常有余阴常不足”等中医理论指导下，从肝“体阴而阴常不足”出发，拟定并制备的育阴软肝颗粒剂在临床上对慢性肝炎、特别是肝纤维化有明显疗效。本实验利用四氯化碳与乙醇的肝毒性，合并营养不均衡的高脂低蛋白饲料来复制肝纤维化动物模型。药物干预后发现，育阴软肝颗粒剂能明显降低肝纤维化大鼠的肝指数，降低血清ALT、AST活性而改善肝功能，降低血清透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原及板层素含量等纤维化指标；肝组织病理学观察显示，育阴软肝颗粒剂可明显缓解肝组织纤维化病理学变化。本次实验同时发现，育阴软肝颗粒剂对肝纤维化的治疗作用弱于秋水仙碱，但考虑到秋水仙碱有较多的不良反应（如消化道反应、骨髓毒性反应、肝肾损害等），育阴软肝颗粒剂在临床使用过程中尚未发现明显的不良反应，因此育阴软肝颗粒剂仍有一定的临床使用价值。

在肝纤维化过程中，致病因素作用于纤维化与抗纤维化的信号网络，使纤维化作用增强或／和抗纤维化作用减弱，最终导致肝细胞间质纤维组织逐渐增加、甚至发展到肝硬化［7］。在肝纤维化的信号网络中，转化生长因子β1（TGF-β1）是关键的促纤维化因 子，在 TLR4／NF-κB／TGF-β1、TGF-β1／Smad／CTGF和 TGF-β1／Smad／ERK等信号通路中发挥核心作用［3，8］。TGF是具有多种功能的蛋白多肽，目前已发现有5种异构体，其中TGF-β1是促进肝纤维化最有力的因子，通过信号网络系统可将信息传递到细胞内，调节靶基因的转录及相关蛋白的合成，进而促进肝星状细胞（HSC）的增殖、分化及细胞外基质（ECM）的合成，加速肝纤维化的发生与发展［9，10］。本实验采用多因素复制大鼠肝纤维化模型，实验证实TGF-β1参与了肝纤维化过程，这与之前的研究相一致［7］。在育阴软肝颗粒剂的干预下，肝组织与血清TGF-β1蛋白表达水平明显下降，提示下调TGF-β1表达是育阴软肝颗粒剂抗肝纤维化的机制之一。

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