鲇源异嗜糖气单胞菌的分离鉴定及药敏特性
2018-06-07胡秀彩陆梦莹孙敬锋吕爱军陈成勋王晓梅
胡秀彩, 陆梦莹, 孙敬锋, 吕爱军, 陈成勋, 王晓梅
(天津市水产生态及养殖重点实验室/天津农学院水产学院,天津 300384)
气单胞菌属(Aeromonas)细菌广泛分布于淡水、海水等水生环境,正常条件下在养殖水体及水产动物体内均存在,多为条件致病菌[1-2]。气单胞菌组成与分类较为复杂,目前在水产动物中发现杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、温和气单胞菌(A.sobria)、维氏气单胞菌(A.veronii)和异嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)等多个种[3]。近年来,国内外有关异嗜糖气单胞菌的研究主要集中在人类和哺乳动物方面[4-5]。Lee等最早从美国腹泻患者体内分离获得异嗜糖气单胞菌,即ATCC35942模式菌株[4]。Saavedra等分离到猪源气单胞菌菌株,经gyrB和16S rRNA基因鉴定为异嗜糖气单胞菌[5]。最近,李欣悦等对气单胞菌分类研究发现gyrA基因在异嗜糖气单胞菌鉴定中更加准确[6]。
关于鱼源异嗜糖气单胞菌的分离鉴定,目前鲜有报道[3,7-8]。刘双凤等从史氏鲟(Acipenserschrencki)体内分离到1株致病菌,经16S rRNA序列分析鉴定为异嗜糖气单胞菌[7]。Martinezmurcia等对欧洲鳗鲡(Anguillaanguilla)CECT4199菌株进行理化特性、16S rRNA分子鉴定研究,确定为异嗜糖气单胞菌[3]。杨求华等从发病鳗鲡(A.japonica)脏器中分离到异嗜糖气单胞菌,动物感染试验证实该菌对鳗鲡具有致病性[8]。本研究首次从自然发病鲇鱼(Silurussp.)腹水等组织中分离出1株细菌,病鱼主要表现为体表出血、肛门红肿突出、腹部膨大等临床症状,采用理化特性结合16S rDNA用基因序列分子鉴定及其药物敏感性,这不仅为异嗜糖气单胞菌的致病机理奠定基础,而且为该病的预防治疗提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
患病鲇(Silurussp.)来自天津某养殖场;2×TaqPCR MixPCR预混体系、DNA Marker DL2000、LB琼脂以及药敏纸片,均购自上海捷瑞生物工程;细菌总基因组提取试剂盒(DNA)、胶回收试剂盒(离心柱型),均购自上海生工生物工程有限公司;肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-11e,购自环凯微生物公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌的分离纯化 参照胡秀彩等的方法[9]进行,无菌操作取患病鲇腹水等组织,接种于LB平板上,28 ℃恒温培养18~24 h。挑取优势单菌落接种纯化,经过2~3次传代纯化后得到纯菌种,置于4 ℃保存备用。菌液按照1 ∶1的比例,取0.5 mL菌液于1.5 mL离心管,加入0.5 mL 40%甘油,封口膜封口,保存于-20 ℃冰箱。
1.2.2 细菌形态特征及理化特性检查 将分离菌株接种于新配制的LB固体培养基上,置于28 ℃培养18 h,肉眼观察菌落形态记录,并进行革兰氏染色镜检。无菌操作接种供试菌株于细菌生化编码鉴定管中,按照常规方法进行硝酸盐还原、糖(醇、苷)类代谢等19种理化特性测定,参照文献[2]进行。
1.2.3 动物感染试验 健康鲇体质量约40.0 g,购自天津某养殖场;斑马鱼体质量约0.5 g,购自天津某水产市场。参照黎烔等的方法[10],将分离到的菌株用0.65%的生理盐水制成2.0×108CFU/mL的菌悬液。选取健康鲇和斑马鱼作为试验对象,采取腹腔注射的方法进行试验。每组10尾鱼,试验组鲇鱼每尾注射0.15 mL菌悬液,斑马鱼每尾注射10 μL菌悬液;对照组鲇鱼、斑马鱼等量注射0.65%无菌生理盐水。试验鱼感染后连续观察7 d,统计鲇和斑马鱼发病死亡情况。
1.2.4 细菌基因组DNA提取 将分离菌株接种于LB液体培养基中,28 ℃、120 r/min振荡培养至对数期后期至菌液浑浊。取2 mL菌液于2 mL离心管中,12 000 r/min离心 2 min,弃去上清液,向离心管中加入500 μL无菌双蒸水,涡旋30 s,置于95 ℃水浴5 min,12 000 r/min离心2 min,以上清液作为模板。
1.2.5 细菌16S rDNA基因序列的扩增及测序 细菌16S rDNA采用通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,引物来自上海生工生物工程有限公司。PCR扩增反应体系(20 μL):2×TaqPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板 1 μL,无菌双蒸水 7 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性40 s,56 ℃ 退火40 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃再延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因,并将PCR扩增产物送金唯智生物科技有限公司进行基因测序。将16S rDNA序列通过NCBI的Blast检索序列同源性分析,采用MEGA 5.05软件邻接法构建系统发育树。
1.2.6 药敏试验 药敏试验采用K-B纸片法对分离菌株进行30种常用抗生素药物的敏感性检测,将分离菌株均匀涂布于LB平板上,依次贴上药敏纸片,28 ℃培养36 h后,测量抑菌圈直径3次,取平均值,以抑菌圈直径大小作为判定细菌对药物敏感性的标准。
2 结果与分析
2.1 分离菌株SJ-2菌体及理化特性
从病鲇腹水中分离纯化获得1株细菌,编号为SJ-2,该菌株在LB固体培养基上形成圆形、透明、表面湿润、边缘整齐的小菌落,为革兰氏染色阴性短杆状,两端钝圆(图1)。细菌生理生化试验结果表明,SJ-2菌株为发酵型细菌,葡萄糖产气、氧化酶、硝酸盐还原、吲哚产生、V-P、枸橼酸盐、尿素、动力、葡萄糖酸盐、赖氨酸脱羧酶为阳性,鸟氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、硫化氢、M.R、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木糖为阴性等,该菌株的菌体形态和生理生化特性基本符合气单胞菌属(Aeromonas)特征。
2.2 分离菌的16S rDNA序列及系统发育分析
以分离菌SJ-2基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增16S rDNA序列,通过琼脂糖凝胶电泳检测大小约为1 500 bp的目的条带(图2),16S rDNA测序获得基因片段长为 1 401 bp;通过Blast检索系统进行基因序列同源性比对,表明菌株SJ-2的16S rDNA基因序列与Aeromonasallosaccharophila模式菌株ATCC51208(=CECT4199,=DSM11576)的16S rDNA序列相似性达99.64%;构建系统发育树分析显示分离菌SJ-2与Aeromonasallosaccharophila亲缘关系最近、自然聚为一支(图3),进一步确定SJ-2为异嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)。
2.3 动物感染试验结果
人工腹腔注射斑马鱼(D.rerio)感染12 h后出现肛门红肿、腹部膨大等症状,48 h死亡率达100%;人工回感染鲇(Silurussp.)出现皮肤变白、局部出血、腹部膨大,解剖有大量腹水等症状,72 h累积死亡率达20%,并且从发病鱼肝脏、腹水等组织中再次分离到与SJ-2菌株特征一致的细菌。生理盐水对照组鱼无发病死亡现象。
2.4 药敏试验结果
表1 菌株SJ-2的药敏试验结果
3 讨论
气单胞菌是一类重要的水产养殖动物病原菌,能导致多种鱼类感染患病,一旦暴发往往造成巨大的经济损失[11]。目前,已有报道显示气单胞菌可引起鱼类、爬行类、两栖类、无脊椎动物和哺乳动物患病,鱼类感染后可引起出血性败血症和流行性溃疡综合征(EUS)等症状[12-13]。气单胞菌组成与分类较为复杂,国外学者最早发现2株异嗜糖气单胞菌菌株,1株来自鳗鲡(A.anguilla),另1株来自腹泻患者[3,5],而且该菌与异嗜糖气单胞菌DNA杂交分类结果一致[14]。Saavedra等从一个患肠胃炎病例分离到1株菌株,经gyrB和16S rRNA基因序列分析鉴定为异嗜糖气单胞菌[5]。Huys等研究表明异嗜糖气单胞菌表型和基因型特征与维氏气单胞菌密切相关[15]。Nhung等通过细菌基因组DNA杂交结合进化树分析,认为异嗜糖气单胞菌与维氏气单胞菌亲缘关系较近[16]。本研究首次从病鲇(Silurussp.)腹水等组织中分离出1株 SJ-2 致病菌,采用理化特性结合16S rDNA用基因序列分子鉴定为异嗜糖气单胞菌,并且构建进化树分析显示与维氏气单胞菌(A.veronii)亲缘关系较近,这与国外学者研究结果[15-16]一致。
研究表明,异嗜糖气单胞菌做为气单胞菌属中新发现鉴定的一个新种,可以感染鲟(A.schrencki)、鳗(A.japonica)等鱼类发病[7-8]。Yanez等从湖水中分离获得A34菌株,根据gyrB基因序列鉴定为异嗜糖气单胞菌,结果表明该菌是一种鱼类病原菌[17]。最近,国内学者从病鱼体内被分离到异嗜糖气单胞菌,而在鲇鱼尚未见文献报道。刘双凤等报道异嗜糖气单胞菌感染史氏鲟(A.schrencki),发病初期病鱼主要表现为食欲减退、行动迟缓,病重时体表颜色深浅不一,病鱼口部四周充血、肿胀,肛门红肿,剖检时发现肝脏质地变脆发白,肠道内没有食物等症状[4]。杨求华等从发病鳗鲡(A.japonica)脏器中分离到异嗜糖气单胞菌,进行动物感染鳗鲡表现为注射部位溃烂、肿大,腹腔肿大,肛门红肿外突,死亡率均超过80%,证实异嗜糖气单胞菌对鳗鲡具有致病性[8]。本研究首次报道异嗜糖气单胞菌感染鲇,临床主要表现为反应迟钝、不摄食、体表出血、肛门红肿突出、腹部膨大,解剖发现腹腔中有大量血性腹水,肠道无内容物、肝脏坏死等症状。人工腹腔注射斑马鱼、鲇鱼呈现体色变白、腹水等症状,这与国内学者等报道该菌感染鲟、鳗等鱼类临床症状[7-8]基本一致。但是,异嗜糖气单胞菌SJ-2菌株感染鲇(Silurussp.)死亡率较低,仅为20%,可能由于异嗜糖气单胞菌为条件致病菌[11],也与鲇鱼抗病力强有关[20]。以上研究结果为鱼源异嗜糖气单胞菌的致病机理研究奠定基础。
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