外周血基因表达分析内参基因的优选

宋 莉，李风华，孙莹莹，宋卫华，宋 燕，柳婷婷，田雪晴，肖 宁，温红艳，张银辉，孟宪敏，陈敬洲

(1.中国医学科学院，北京协和医学院，国家心血管病中心，阜外医院，心血管疾病国家重点实验室，北京 100037；2.北京大学医院内科，北京 100871)

基因转录水平的表达分析是生命科学最重要的研究领域。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)是近年来应用最广泛的定量分析技术[1～3]，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、通量高等优点，成为研究基因表达分析的重要工具。相对定量法作为最常用的定量分析方法，应用的前提是必须要有合适的内参基因(reference gene)对目的基因进行标准化处理，以校正转录效率和cDNA用量，避免从样品采集到cDNA制备等诸多步骤的处理造成的误差[4，5]。

理想的内参基因在不同的组织或细胞中的表达水平应该相对稳定，通常选用维持细胞基本生命活动的管家基因(housekeeping gene)。常用的内参基因，在不同的组织和细胞类型、不同的实验条件与个体间，表达量并不恒定，而且仅用一种内参基因的定量分析误差较大，应挑选多个表达比较稳定的内参基因(一般2～3)共同参与校准，从而提高结果的准确性[6，7]。

外周血是人类疾病研究中最为常用和最容易获取的生物样本，其基因表达定量分析对疾病的研究具有重要的价值[8，9]。本文采用实时荧光定量PCR方法，利用qBASE+软件，选取并分析了外周血RNA内参基因GAPDH 、ACTB、PPIB、TRAP1、DECR1的表达稳定性，进而得到一组最适合的内参基因，为准确、真实的分析该类外周血的基因表达提供依据。

1 材料与方法

1.1冠心病人群外周血样品的收集病例收集时间为2016年10月至2017年6月。冠心病病例48例，其中男26例(54.2%)，年龄40～70岁，平均56.4岁，来自阜外医院，均经冠脉造影证实，判断标准为主要冠脉狭窄程度大于50%。正常对照50例，包括冠状动脉造影证明狭窄程度小于20%且无任何血管疾病者及随机无冠心病史的健康社区居民，男23例(46%)；45～83岁，平均60.1岁；两组性别和年龄比较，差异无统计学意义。样本采集经过阜外医院伦理委员会同意和批准，并签订了知情同意书。样品用PAXgeneTM全血RNA管(美国BD公司，Cat.762165)采集。

1.2内参基因的选择选择2个常用的内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、肌动蛋白(βactin beta，ACTB)，和基于已有文献的报道3个管家基因2，4-双烯酰辅酶A还原酶1(2，4-dienoyl CoA reductase 1，mitochondrial，DECR1)、 肽基脯氨酰异构酶B(peptidylpropyl isomerase B，PPIB)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TNF receptor associated protein 1，TRAP1)[10]，具体基因信息见表1。

表1 内参基因基本信息和定量PCR引物

1.3外周血RNA的提取和cDNA的制备采用PAX Blood RNA Kit(Qiagene，Cat.762174)提取外周血RNA，单核细胞系THP1总RNA采用Trizol法提取。Nanodrop测定RNA浓度，OD260/280在1.8以上。外周血RNA采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara，Cat.RR047A)合成cDNA，反应为20 μl，含700 ng总RNA，oligo dT终浓度为2.5 μM，反应温度50 ℃ 15 mins，85 ℃ 5 s。THP1 cDNA合成采用SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix(Cat18080-400，invitrogen)，20 μl反应含5 μg总RNA，random primer 和 oligo dT终浓度2.5 μM，反应温度为25 ℃ 10 mins，50 ℃ 50 mins，85 ℃ 5 mins。

1.4实时荧光定量PCR的检测引物序列见表1。反应体系15 μl，2×SYBR Green Master Mix(ABI，Cat.A25742)7.5 μl，引物终浓度为0.2 μM，模板体积为3 μl。模板用量：基因ACTB和GAPDH的表达水平较高，模板用量为1.875 ng；基因PPIB，TRAP1和DECR1为30 ng。反应在ViiATM7? real-time PCR instruments(Life technologies)上进行，温度为：95 ℃，5 mins；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40个热循环。标准曲线模板制备：以THP1 cDNA为模板，基因ACTB和GAPDH，起始用量为9.375 ng，共有 8个标准品点；基因PPIB，TRAP1和DECR1起始用量为150 ng，共有6个标准品点，稀释比为1∶4。

1.5内参基因稳定性分析原始的Ct均值导入分析软件qBASE+，计算内参基因稳定性，由geNorm M表示，数值越小越稳定。根据geNorm M值，进一步计算基因组合geNorm V值，找到geNorm V<0.15的最佳内参基因组合。

2 结果

2.1定量PCR扩增效率分析内参基因的扩增效率在90～100%，满足相对定量分析时基因扩增效率控制在90%～105%。全部样品的Ct值均在标准曲线内，定量基因扩增效率，线性范围，线性相关值R2，见表2。

表2 内参基因定量PCR扩增结果

2.2内参基因表达水平分布内参基因Ct值的中位数，四分位距(interquartile range，IQR)和Ct值变化范围，见图1。通过Ct值的极差，可以看到常用内参基因ACTB最不稳定，见表2。采用qBASE+软件计算稳定性值geNorm M，稳定度由高到低依次为DECR1> GAPDH > TRAP1> PPIB >ACTB，具体数值为0.565、0.567、0.578、0.619、1.020，见图2。

图1 内参基因原始Ct值基本信息，以中位数、四分位距和Ct值范围表示

图2 内参基因平均稳定度趋势图

2.3最佳内参基因组合的确定应用qBASE+进一步计算配对变异V值(geNorm V)，确定最适内参基因的数目，以配对变异geNorm V <0.15为阈值，V2/3、V3/4、V4/5的数值分别是0.179、0.143、0.316，说明最稳定的组合为3个内参基因，按照稳定性由高到底排序为DECR1，GAPDH和TRAP1，因此，该3个基因是外周血基因表达分析的最佳内参基因组合，见图3。

图3 内参基因配对变异V值(geNorm V)结果图 绿线表示geNorm V=0.15的阈值，根据Vn/Vn+1的比值小于0.15确定最适内参基因的数目，V3/4=0.143，说明最佳组合为3个内参基因。

3 讨论

采用内参基因组作为定量PCR校准和标准化的分析是2002年由Jo Vandesompele 提出的，并开发了软件geNorm，2007年成为软件qBASE+的一部分[11]。该软件将某一管家基因与其他管家基因表达水平的两两比值经对数变换后，计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值geNorm M，对所有候选管家基因的表达稳定度进行排序，并通过配对差异分析最终筛选出2个或2个以上的内参基因组合用于校正数据，这对于基因在表达水平的准确定量具有极其重要的意义。

已有的研究发现，由于研究的细胞类型和组织不同，或者是同一组织不同的发育阶段，同一组织不同的疾病类型，常用的管家基因表达水平往往变异很大，一般不适合作为定量PCR的内参基因。本研究选择了3个中等表达丰度的管家基因DECR1、TRAP1和 PPIB，和2个常用的内参基因ACTB和GAPDH，以98例冠心病病例和正常对照为研究对象，通过定量PCR技术检测了分析外周血基因表达稳定性，得到五个内参基因的稳定度，由高到低依次为DECR1> GAPDH > TRAP1> PPIB >ACTB，据此筛选出了可用于该类疾病基因表达水平的内参基因组合DECR1，GAPDH和TRAP1，为应用定量PCR准确分析疾病相关基因的表达分析提供了可靠的依据。研究中从标本的规范化收集、RNA的产量和质量，逆转录的效率，以及定量PCR扩增效率等多个方面保证了结果的准确可靠，从而可为准确、真实的分析该类外周血的基因表达提供依据.

[1] Wang H，Li W，Guo R，et al.An intragenic long noncoding RNA interacts epigenetically with the RUNX1 promoter and enhancer chromatin DNA in hematopoietic malignancies[J].Int J Cancer，2014，135(12)：2783-2794.

[2] Knight JS，Luo W，O’Dell AA，et al.Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis[J].Circ Res，2014，114(6)：947-56.

[3] 彭端亮，刘成桂，缪晓燕，等.Taqman定量PCR检测宫颈癌样本中CXCL12和CXCR4基因表达水平[J].实用医院临床杂志，2017，14(5)：16-19.

[4] Zampieri D，Nora LC，Basso V，et al.Validation of reference genes in Penicillium echinulatum to enable gene expression study using real-time quantitative RT-PCR[J].Curr Genet，2014，60(3)：231-236.

[5] Cui B，Smooker PM，Rouch DA，et al.Selection of suitable reference genes for gene expression studies in Staphylococcus capitis during growth under erythromycin stress[J].Mol Genet Genomics，2016，291(4)：1795-811.

[6] Vandesompele J，De Preter K，Pattyn F，et al.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J].Genome Biol，2002，3(7)：research 0034.1-0034.11.

[7] Sadek KH，Cagampang FR，Bruce KD，et al.Variation in stability of housekeeping genes in healthy and adhesion-related mesothelium[J].Fertil Steril，2012，98(4)：1023-1027.

[8] D’Amore S，Vacca M，Graziano G，et al.Nuclear receptors expression chart in peripheral blood mononuclear cells identifies patients with Metabolic Syndrome[J].Biochim Biophys Acta，2013，1832(12)：2289-2301.

[9] Tang Q，Danila MI，Cui X，et al.Expression of Interferon-γ Receptor Genes in Peripheral Blood Mononuclear Cells Is Associated With Rheumatoid Arthritis and Its Radiographic Severity in African Americans[J].Arthritis Rheumatol，2015，67(5)：1165-1170.

[10]Stamova BS，Apperson M，Walker WL，et al.Identification and validation of suitable endogenous reference genes for gene expression studies in human peripheral blood[J].BMC Med Genomics，2009，2：49.

[11]Hellemans J，Mortier G，De Paepe A，et al.qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data[J].Genome Biol，2007，8(2)：1-14.