缺氧诱导因子2的结构与功能

李少瑛 吴靖芳 薛 刚

(河北北方学院临床医学2012级，河北 张家口 075000)

缺氧是肿瘤微环境的基本特征之一。局部缺氧时肿瘤细胞为了维持自身能量代谢，发生一系列适应性改变，如糖酵解增加、保护性应激蛋白〔如促红细胞生成素(EPO)，血管内皮生长因子(VEGF)〕的表达增高等。通过激活和抑制促进肿瘤细胞存活、增殖、侵袭和疾病进展的一些基因来驱动癌细胞的生存和发展，在一些肿瘤中缺氧和缺氧诱导因子(HIF)与预后不良相关。HIF有HIF-1，HIF-2和HIF-3三种亚型。HIF-1表达于所有细胞中，是研究最广泛且在肿瘤领域研究已较为成熟的。HIF-2在肿瘤中的研究相对较少。本文就HIF-2的结构、调节、表达及其在肿瘤中的作用机制进行综述。

1 HIF-2的结构

HIF是由α和β两种亚基组成的一种异源二聚体，α亚基是严格受氧浓度的调控的功能亚基；β亚基又称芳香羟受体核转运蛋白(ARNT)，组成性表达于细胞核，不受氧浓度影响，与保持HIF的结构稳定性及其二聚化后转活化有关，所以HIF的研究主要集中在α亚基〔1，2〕。HIF-2最早是在1997年由Tian等〔3〕在内皮细胞克隆出来的，又名内皮PAS1蛋白(EPAS1)、组胺释放因子(HRF)和HIF相似因子(HLF)等，与血管生长、骨髓造血、能量代谢、肿瘤发生发展密切相关〔4，5〕。人HIF-2α基因定位于2号染色体P16～21区，开放阅读框架为607 bp编码的869个氨基酸，分子质量为96.5 kb。由碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)、PAS、氧依赖的降解结构域氧依赖的降解结构域(ODD)和转录激活结构域(TAD)结构域组成。N-端有bHLH、PAS-A和PAS-B三个结构域，与HIF-1α的同源性分别为99%、91%和96%〔6〕。在C-端，具有两个转录激活结构域：氨基酸端激活域(NAD或NTAD)和羟基端激活域(CAD或CTAD)〔7，8〕。NTAD在HIF-2α调节不同靶基因的主要结构域〔7〕，而CTAD在缺氧条件下富集转录辅助激活因子，如p300/CBP〔 9，10〕。作为转录因子的HIF-2α，其蛋白中存在富含碱性氨基酸(Lys和Arg)片段的核定位信号(NLS)，NLS在缺氧时能够特异性的定位在细胞核内。HIF-2α的氨基酸序列为NLS：KRQLEYEKQAFQDPSGGDPPGGSTSHLMWKR〔11〕。见图1。

HIF-2α与HIF-1α均含有bHLH 和 PAS结构域，ODDs、NADs、CADs，百分数代表HIF-1α和HIF-2α各个结构中氨基酸的相似程度图1 HIF-α结构示意

2 HIF-2α表达的调节

2.1HIF-2α基因水平调节 HIF-2α基因水平的调节研究较少，且在不同株细胞中表达差异较大。在小鼠胚胎HIF-2α mRNA几乎只表达于内皮细胞中，因此HIF-2α又名EPAS1。基因水平上调节HIF-2α表达的因子较少，Narano-Suárez等〔12〕报道神经生长因子(NGF)可稳定抑制大鼠嗜铬细胞瘤(PC)细胞中HIF-2α mRNA的表达，即使在放线菌素D存在的条件下仍无改变。骨桥蛋白抑制骨关节炎软骨细胞内HIF-2α mRNA表达〔13〕。白细胞介素(IL)-1β可明显上调心肌细胞HIF-2α mRNA的表达，且与时间、剂量相关〔14〕。神经母细胞瘤缺氧24 h HIF-2α mRNA和蛋白一致升高，至72 h达高峰，其下游VEGFA与之变化一致。RNAi介导的雌激素相关受体(ERR)α降低可导致常氧和低氧状态神经母细胞瘤HIF-2α mRNA表达水平〔15〕。胰岛素样生长因子(IGF)2可以在转录水平和翻译后促进神经母细胞瘤和未成熟的交感神经母细胞内HIF-2α高表达〔16〕。

2.2蛋白质水平调节 在蛋白质水平调节HIF-2α表达的因子中，缺氧是最主要的调节因子，如O2/脯氨酰羟化酶结构域(PHDs)/pVHL途径较为经典。

常氧时，细胞中HIF-2α处于不断被合成和降解的动态平衡中，半衰期很短。ODD结构域中特定的脯氨酸残基Pro405和Pro531被脯氨酰羟化酶结构域(PHD)蛋白识别并羟基化，被羟化的ODD促进HIF-2α与E3泛素连接酶复合体的VHL结合为pVHL复合体，并富集elongin-C/elongin-B/cullin-2 E3泛素连接酶，导致HIF-α降解〔17〕。其中PHD是该降解途径的关键酶。哺乳动物中PHD存在4种成员(PHD1、PHD2、PHD3和P4H-TM)。体外实验表明，HIF-2α主要由PHD1和PHD3调节；而HIF-1α主要由PHD2调节，在体内HIF-1α降解的关键限速酶是PHD2〔18〕。当氧气浓度低于2%时，HIF-α亚基的氧依赖降解途径被抑制〔16，17〕。见图2。

bHLH DNA结合域，PAS 结构域和TADs、PHDs。常氧条件下，特异性脯氨酸羟化酶PHD使405和531位脯氨酸残基处于羟化状态，HIF-2α与VHL结合为pVHL复合体，富集 E3 泛素连接酶，导致HIF-2α降解，Asp847位氨基酸被HIF-1α抑制因子(FIH-1)羟化，抑制CTAD与CBP/p300结合图2 常氧情况HIF-2α结构示意

3 HIF-2α的转录激活

天冬氨酸羟化酶又称为FIH-1，可调节HIF-α亚基的转录。FIH-1蛋白在所有组织，细胞表达水平相似，免疫组化显示FIH-1稳定表达于细胞质。常氧情况下，FIH-1主要位于细胞质并能修饰和沉默HIF-α。体外培养细胞缺氧或缺氧模型并不改变其胞质表达〔19〕。FIH-1催化时需要氧气和底物2-酮戊二酸。常氧时，FIH-1可以羟基化修饰人类HIF-2α的Asn847位点，阻止HIF-2α的CAD结构域富集共激活因子p300/CBP以抑制HIF的转录激活功能。而低氧时，由于O2不足，FIH-1未羟基化，HIF-2α可以富集p300/CBP及其他一些特定的辅助因子并与HIF-β结合形成有转录活性的复合体〔6,20,21〕。见图3。

常氧时，FIH-1介导的羟化作用阻止CAD 结构域富集共激活因子p300/CBP，抑制HIF的转录激活功能；低氧时FIH-1不能催化CAD羟化，CBP/p300与CAD结合活化靶基因图3 HIF-α转录激活示意

缺氧相关因子(HAF) 可以作为一种新的E3连接酶，与HIF-1α结合形成HIF-1α-E3-HAF复合体，与DNA上的HIF-2α结合促进HAF小泛素样修饰蛋白(SUMO)蛋白质修饰的HIF-2α转录。HAF SUMO蛋白质修饰由缺氧诱导，而HAF介导HIF-1α降解不依赖于HAF SUMO蛋白质修饰。小鼠HAF过表达增加囊性肾癌(CRCC)生长和转移，临床上HAF过表达则与不良预后有关〔22〕。

此外，磷酸化、去乙酰化等都能对HIF-α 的转录功能进行调控。NAD+依赖性去乙酰化酶Sirtuin1(Sirt1)在缺氧情况下能活化HIF-2α，继而导致蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPR)Z1过表达〔23〕。在转录激活时，HIF与低氧反应元件(HRE)的结合不能启动靶基因〔4〕。α亚基中的CTAD结构域对转录辅助激活因子的富集是必不可少的一步。p300/CBP是HIF-1和HIF-2 转录时共同的辅助激活因子，但细胞内还存在其他辅助激活因子〔8〕，如E26转录因子(ETS)转录因子家族中的ETS-1、转录激活因子ETS样蛋白(ELK)-1及NF-κB必需调节蛋白(NEMO)〔24〕等均能与HIF-2α特异性结合，上调HIF-2α的转录。见图4。

A.Ets家族与HIF-2α共同活化激活靶基因;B.独立活化靶基因图4 转录依赖功能

4 HIF-2的作用

4.1组织分布 HIF-2α表达于多个器官的实质和间质细胞，啮齿动物暴露于系统性缺氧时，通过免疫组织化学法可以稳定观察到肾间质细胞、肝细胞、十二指肠上皮细胞、心肌细胞和星形胶质细胞均有HIF-2α表达。体外研究〔25〕表明在氧张力较高的情况下HIF-2α比HIF-1α稳定，缺氧时HIF-2α mRNA变化不明显，HIF-2α蛋白积累主要发生在翻译后调节阶段。在氧传递系统的组织和器官HIF-2α mRNA水平都特别高，如肺和心脏。缺氧引起HIF-2α蛋白稳定表达于肺的Ⅱ型肺泡细胞和肺内皮，而检测不到HIF-1α表达。胚胎发育晚期肺内HIF-2α转录也调节肺的发育、HIF-2α还高表达于胚胎发育中的主动脉旁体(合成儿茶酚胺的重要位点)。分析心肌缺血HIF-α染色模式表明，急性反应的α亚基主要发生梗死组织周围，包括心肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞。随着时间的推移远处心肌可检测HIF-2α。这些低氧诱导因子不同时空模式的表达表明，两个α亚基可能是在组织缺氧适应性反应中独特和互补的角色〔25〕。

4.2HIF-2α在肿瘤中的作用 HIFs是氧动态平衡的重要传感器。恒定HIF活化是许多癌症中的一个共同特征，并且日益成为被认为是治疗性干预的靶基因〔26〕。HIF- 2α在骨关节炎的软骨高于周围正常软骨，通过上调分解代谢基因〔如基质金属蛋白酶(MMP)1，3，9，12和13〕的表达水平，HIF-2α在软骨关节炎形成中有重要作用，所以可作为该病的治疗靶点〔27〕。大多数实体肿瘤经常形成缺氧、低氧环境，导致快速增殖的肿瘤在肿瘤周围形成新生血管，转分化细胞和正常细胞主要是通过稳定HIF-1α和HIF-2α氧敏感α亚单位适应缺氧环境。HIF-2α通过与HRE结合而启动靶基因表达，调节多个基因(如肾上腺髓质素、葡萄糖载体蛋白1、IL-6、脂肪细胞分化相关蛋白等)促进肿瘤细胞的存活、进展、细胞外基质重塑和细胞迁移、细胞周期调控、DNA损伤反应、增殖和凋亡等〔6〕。国外一些研究发现许多基因被HIF-2优先调节，包括CITED2、EPO、纤溶酶原激活物抑制物(PAI)-1、酪氨酸激酶基因(Tie2/TEK)、VEGF受体、脂氧合酶(LOX)和PTPRZ1基因，这是导致HIF-2特异性的机制〔20〕。

4.2.1HIF-2α与CITED2 HIF-2α和ELK1之间的相互作用使HIF-2优先激活CITED2。有对肝癌细胞的研究发现CITED2作为一个潜在的HCC肿瘤抑制基因〔28〕。CITED2是HCC内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的一个直接效应基因。CITED2在肿瘤中的作用并不清楚，敲除CITED2，通过转化生长因子(TGF)β1途径降低MMP-9和细胞侵袭力增加缺氧诱导的乳腺癌细胞死亡；然而CITED2缺失可使结肠癌细胞侵袭力增加。Wang等〔29〕报道甲状腺乳头状癌组织HIF-2与淋巴结转移有关。另外，国外有研究发现在缺乏雌激素和他莫昔芬的情况下CITED2超表达促进乳腺癌细胞体外生长，表明CITED2水平升高可能导致肿瘤生长和雌激素治疗耐受〔28〕。

4.2.2HIF-2α与PTPRZ1 PTPRZ1局限表达于中枢神经系统，在脱髓鞘病恢复中有重要作用。Wang等〔15〕研究表明HIF-1和HIF-2α基因活化分别上调不同基因，确认PTPRZ1可被HIF-2α优先上调6倍之多。研究发现大部分HIF-2激活PTPRZ1可以归因于HRE4启动子区域一个HRE反义链的序列-TACGCACGCACGA-，HIF-2α与PTPRZ1启动子区的ELK1的E26基序优先结合激活PTPRZ1〔30〕。PTPRZ1在很多癌症高表达，如肝癌、肾癌和神经母细胞瘤〔15，30〕。最近有报道表明PTPRZ1是也可由慢性氧化应激引起，在氧化应激下Sirt1可能通过增强HIF-2α活动，进而促进PTPRZ1的过度表达〔23〕。PTPRZ1及其配蛋白在人类胶质母细胞瘤过度表达，并有证据〔30〕表明，这些蛋白质在癌症的发病机制中发挥重要作用。进一步证据表明小干扰RNA胶质母细胞瘤的HIF-2α基因，检测PTPRZ1在体外和体内的PTPRZ1高表达。此外，PTPRZ1的单克隆抗体已被证明有延迟胶质母细胞瘤模型中肿瘤生长的作用〔31〕。

4.2.3HIF-2α与VEGF 肿瘤的过度增长使组织缺血、缺氧，导致HIF-2α过度的表达，激活多种信号转导通路，如增殖和侵袭相关基因如cyclin D1、c-Myc和E-cadherin，LOX，CXCR4，TWIST等，增强实体肿瘤的侵袭性；促进血管和淋巴管新生相关基因，如血管内皮生长因子、红细胞生成素，血管生成素与Tie-2 受体〔32〕。VEGF是HIF-2α优先调节的靶基因，HIF-2α激活其下游靶基因VEGF，主要通过与VEGF基因的增强子结合使VEGF mRNA的转录水平升高，上调VEGF的表达，继而与血管内皮表面的VEGF受体结合，使VEGF mRNA和蛋白的表达量增加，从而诱导新生血管的生成，提高实体肿瘤适应低氧微环境，引发一系列肿瘤生物学行为〔33〕。HIF-2α和VEGF与肾癌的生长密切相关，shRNA沉默HIF-2α基因，VEGF在肾癌细胞株中低表达，证实VEGF为HIF-2α下游靶基因之一，可以诱导VEGF的表达。HIF-2α可能成为治疗肾癌新的有效靶点〔34〕。

5 参考文献

1Aebersold DM，Burri P，Beer KT，etal.Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha：a novel predictive and prognostic parameter in the radiotherapy of oropharyngeal cancer〔J〕.Cancer Res，2001；61(7)：2911-6.

2Hogenesch JB，Chan WK，Jackiw VH，etal.Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-PAS superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway〔J〕.Biol Chem,1997；272(13)：8581-93.

3Tian H，McKnight SL，Russell DW.Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1)，a transcription factor selectively expressed in endothelial cells〔J〕.Genes Dev,1997；11(1)：72-82.

4Patel SA，Simon MC.Biology of hypoxia-inducible factor-2α in development and disease〔J〕.Cell Death Differ，2008；15(4)：628-34.

5Shah T，Krishnamachary B，Wildes F，etal.HIF isoforms have divergent effects on invasion，metastasis，metabolism and formation of lipid droplets〔J〕.Oncotarget,2015；6(29)：28104-19.

6Lisy K，Peet DJ.Turn me on：regulating HIF transcriptional activity 〔J〕.Cell Death Differ，2008；15(4)：642-9.

7Patel SA，Simon MC.Biology of hypoxia-inducible factor-2α in development and disease〔J〕.Cell Death Differ，2008；15(4)：628-34.

8Loboda A，Jozkowicz A，Dulak J.HIF-1 and HIF-2 transcription factors-similar but not identical〔J〕.Mol Cell，2010；29(5)：435-42.

9Hu CJ，Sataur A，Wang L，etal.The N-terminal transactivation domain confers target gene specificity of hypoxia-inducible factors HIF-1α and HIF-2α〔J〕.Mol Biol Cell，2007；18(11)：4528-42.

10Arany Z，Huang LE，Eckner R，etal.An essential role for p300/CBP in the cellular response to hypoxia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1996；93(23)：12969-73.

11Luo JC，Shibuya M.A variant of nuclear localization signal of bipartite-type is required for the nucleartranslocation of hypoxia inducible factors (1α，2α and 3α)〔J〕.Oncogene，2001；20(12)：1435-44.

12Naranjo-Suárez S，Castellanos MC，Alvarez-Tejado M，etal.Down-regulation of hypoxia-inducible factor-2 in PC12 cells by nerve growth factor stimulation〔J〕.J Biol Chem，2003；278(34)：31895-901.

13Cheng C，Zhang FJ，Tian J,etal.Osteopontin inhibits HIF-2α mRNA expression in osteoarthritic chondrocytes〔J〕.Exp Ther Med，2015；9(6)：2415-9.

14Tanaka T，Akiyama H，Kanai H，etal.Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1) induces adrenomedullin gene expression in cardiac myocytes：role of EPAS1 in an inflammatory response in cardiac myocytes〔J〕.Mol Cell Cardiol，2002；34(7)：739-48.

15Wang V，Davis DA，Haque M，etal.Differential gene up-regulation by hypoxia-inducible factor-1alpha and hypoxia-inducible factor-2alpha inHEK293T cells〔J〕.Cancer Res，2005；65(8)：3299-306.

16Mohlin S，Hamidian A，Påhlman，S，etal.HIF2aα and IGF2 expression correlates in human neuroblastoma cells and normal immature sympathetic neuroblasts〔J〕.Neoplasia，2013；15(3)：328-34.

17Weidemann A，Johnson RS.Biology of HIF-1α〔J〕.Cell Death Differ，2008；15(4)：621-7.

18Hodson EJ，Nicholls LG，Turner PJ，etal.Regulation of ventilatory sensitivity and carotid body proliferation in hypoxia by the PHD2/HIF-2 pathway〔J〕.J Physiol，2016;594(5):1179-95.

19Koh MY，Darnay BG，Powis G.Hypoxia-associated factor，a novel E3-ubiquitin ligase，binds and ubiquitinates hypoxia-inducible factor 1α，leading to its oxygenindependent degradation〔J〕.Mol Cell Biol，2008；28(23)：7081-95.

20Aprelikova O，Wood M，Tackett S，etal.Role of ETS transcription factors in the hypoxia-inducible factor-2 target gene selection〔J〕.Cancer Res，2006；66(11)：5641-7.

21Hu CJ，Wang LY，Chodosh LA，etal.Differential roles of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and HIF-2α in hypoxic gene regulation〔J〕.Mol Cell Biol，2003；23(24)：9361-74.

22Koh MY，Nguyen V，Lemos R Jr，etal.Hypoxia-induced SUMOylation of E3 ligase HAF determines specific activation of HIF2 in clear-cell renal cell carcinoma〔J〕.Cancer Res,2015；75(2)：316-29.

23Dioum EM，Chen R，Alexander MS，etal.Regulation of hypoxia-inducible factor 2alpha signaling by the stress-responsive deacetylase sirtuin 1〔J〕.Science，2009；324(5932)：1289-93.

24Elvert G，Kappel A，Heidenreich R，etal.Cooperative interaction of hypoxia-inducible factor-2α (HIF-2α) and Ets-1 in the transcriptional activation of vascular endothelial growth factor receptor-2 (Flk-1)〔J〕.J Biol Chem，2003；278(9)：7520-30.

25Patel SA，Simon MC.Biology of hypoxia-inducible factor-2alpha in development and disease〔J〕.Cell Death Differ，2008；15(4)：628-34.

26Semenza GL.Targeting HIF-1 for cancer therapy〔J〕.Nature Rev Cancer,2003；(10)：721-32.

27Yang S，Kim J，Ryu JH，etal.Hypoxia inducible factor 2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction〔J〕.Nat Med,2010;16(6)：687-93.

28Lau WM，Doucet M，Huang D，etal.CITED2 modulates estrogen receptor transcriptional activity in breast cancer cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;437(2)：261-6.

29Wang N，Luo HJ，Yin GB，etal.Overexpression of HIF-2α，TWIST，and CXCR4 is associated with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma〔J〕.Clin Dev Immunol,2013；2013：589423.

30Wang V，Davis DA，Veeranna RP，etal.Characterization of the activation of protein tyrosine phosphatase，receptor-type，Z polypeptide1(PTPRZ1) byhypoxia inducible factor-2 alpha〔J〕.PLoS One,2010;5(3)：e9641-52.

31Foehr ED，Lorente G，Kuo J，Ram R，etal.Targeting of the receptor protein tyrosine phosphatase beta with a monoclonal antibody delays tumor growth in a glioblastoma model〔J〕.Cancer Res，2006;66(4)：2271-8.

32Qing G，Simon MC.Hypoxia inducible factor-2α：a critical mediator of aggressive tumor phenotypes〔J〕.Curr Opin Genet Dev，2009;19(1)：60-6.

33Ratcliffe PJ.HIF-1α,HIF-2α：working alone or together in hypoxia〔J〕.Clin Invest,2007;117(4)：862-5.

34巩进伟，段建敏，卢建中，等.shRNA沉默肾癌786-O和OS-RC-2细胞株中HIF-2α的表达对VEGF的影响〔J〕.现代泌尿生殖肿瘤杂志，2014;6(4)：239-40.