整合素在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其机制

魏明波

(武汉大学中南医院口腔科，湖北 武汉 430071)

牙龈蛋白酶是牙龈卟啉单胞菌分泌出的半胱氨酸蛋白酶，其中精氨酸牙龈蛋白酶(RGP)、赖氨酸牙龈蛋白酶(KGP)两种亚型可降解人牙龈成纤维细胞、上皮细胞，诱导细胞凋亡〔1〕。整合素α5、β1蛋白分布于细胞表面通过非共价键结合的二聚体，调节成骨细胞增殖和分化〔2〕。成骨细胞作为牙周组织主要成分之一，其代谢情况对牙周组织退化、修复具有重要意义〔3〕。老年人多因牙周组织退化导致牙齿松动和脱落，对日常生活造成不良影响。本研究主要探讨整合素α5、β1在牙龈蛋白酶诱导人成骨细胞凋亡中的表达变化及其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人颅骨成骨细胞(HCO)，HL-60细胞购于上海斯信生物科技有限公司；牙龈卟啉单胞菌W83购于上海继和生物科技有限公司；胎牛血清，α-mem液体培养基购于上海源叶生物科技有限公司；脑心浸液肉汤购于上海星科生物科技有限公司；生物素原位缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒，膜蛋白提取试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路抑制剂LY294002，兔整合素α5抗体，鼠抗人整合素β1抗体，山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G购于上海远慕生物科技有限公司。

1.2HCO培养和牙龈蛋白酶提取 用含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的α-mem液体培养基，5%CO2培养箱中孵育HCO，取对数生长期细胞进行实验。用含0.5%酵母提取物、300 g/L维生素K、2 mg/L的氯化血红蛋白的脑心浸液肉汤，在70%N2、5%CO2、5%H2的厌氧罐中孵育牙龈卟啉单胞菌，取对数生长期细菌培养液上清提取纯牙龈蛋白酶，酶标仪显示，牙龈蛋白酶中RGP活性浓度(42.85±3.22)U/L，KGP活性浓度为(1.13±0.36)U/L，本次实验中使用两者的混合物。使用RGP特异性底物(BAPNA)和KGP特异性底物(ALNA)检测蛋白酶活性，RGP、KGP与特异性反应底物生成硝基苯胺，将每分钟生成1 pmol硝基苯胺需要的蛋白酶量作为1个活性单位。

1.3细胞凋亡检测和细胞膜蛋白提取 TUNEL-4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光双染色法检测HCO凋亡情况：取对数生长期HCO制备细胞爬片，观察组用6.840 U/L的牙龈蛋白酶处理HCO 48 h；阳性对照组用1.0 mg/L的放线菌素D处理HL-60细胞24 h诱导凋亡；空白对照组不用牙龈蛋白酶处理HCO；使用TUNEL细胞凋亡试剂盒进行检测，按说明进行样本固定、染色、拍照。取对数生长期HCO，弃去原培养基，使用膜蛋白提取试剂盒提取HCO膜蛋白，-80℃保存待用。

1.4Western印迹检测整合素α5、β1蛋白表达 取对数期HCO按1×106/孔接种到6孔板中，进行下列分组与处理：①用不同浓度的牙龈蛋白酶(0.000、0.342、0.684、1.710、6.840、17.100 U/L)处理HCO 48 h；②用相同浓度的牙龈蛋白酶6.840 U/L处理HCO不同时间(0、8、16、24、48、72 h)；③先用0.3 mmol/L的PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002处理HCO，再用相同浓度的牙龈蛋白酶6.840 U/L处理HCO 0、24、48、72 h。提取细胞总蛋白并测定浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，湿法转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭，滴加一抗(兔整合素α5抗体、鼠抗人整合素β1抗体、β-actin)均1∶500稀释，二抗(山羊抗兔IgG)，孵育后电化学发光，凝胶成像系统拍照，以β-actin为内参计算相对灰度值。

1.5统计学方法 应用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1牙龈蛋白酶活性及诱导HCO凋亡 健康成骨细胞TUNEL染色呈阴性，DAPI染色呈阳性(蓝色荧光)；凋亡成骨细胞TUNEL和DAPI染色均为阳性(呈蓝色和绿色荧光)；牙龈蛋白酶作用48 h后阳性对照组及观察组HCO凋亡细胞数目较空白对照组明显增多。见图1。

图1 各组倒置荧光显微镜下TUNEL-DAPI染色结果(×200)

2.2不同浓度牙龈蛋白酶对HCO中整合素α5、β1蛋白表达的影响 与0.000 U/L牙龈蛋白酶浓度相比，牙龈蛋白酶能够明显下调HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平，且随浓度增加逐渐增强，各浓度之间差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表1。

图2 不同浓度牙龈蛋白酶处理HCO 48 h后检测条带

表1 不同浓度牙龈蛋白酶处理HCO整合素α5、β1蛋白表达情况

与0.000 U/L比较：1)P<0.05；与前一浓度比较：2)P<0.05

2.3不同作用时间牙龈蛋白酶对HCO中整合素α5、β1蛋白表达的影响 随着牙龈蛋白酶作用时间延长，HCO中整合素α5、β1蛋白表达水平逐渐下调，各时间点之间差异均有统计学意义(P<0.05)。牙龈蛋白酶作用16 h、24 h、48 h、72 h时整合素β1蛋白表达水平均明显低于同期整合素α5蛋白表达水平(P<0.05)。见图3，表2。

图3 不同时间作用下6.840 U/L牙龈蛋白酶处理HCO后检测条带

表2 不同时间作用下HCO中整合素α5、β1蛋白表达情况

与整合素α5比较：1)P<0.05；与前一作用时间比较：2)P<0.05

2.4LY294002对HCO中整合素α5、β1蛋白表达的影响 LY294002处理HCO后，6.840U/L牙龈蛋白酶处理HCO 0、24、48、72 h时整合素α5蛋白表达量分别为(1.000±0.000)、(1.076±0.005)、(1.046±0.007)、(0.982±0.015)；整合素β1蛋白表达量分别为(1.000±0.000)、(1.041±0.011)、(1.009±0.018)、(1.001±0.009)。各时间点整合素α5、β1蛋白表达水平之间差异均无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 LY294002处理后各时间点整合素α5、β1蛋白表达情况

3 讨 论

牙龈蛋白酶包存在于牙龈卟啉单胞菌外膜或胞外，是破坏宿主组织的毒力因子。相关研究显示，牙龈蛋白酶可诱发牙周组织细胞凋亡，导致牙周结缔组织丧失〔4〕。相关动物实验发现，用牙龈卟啉单胞菌感染大鼠成骨细胞后凋亡水平明显增加，相应的骨组织缺失也明显高于正常对照组〔5〕，提示成骨细胞凋亡是阻碍牙槽骨修复的重要机制之一。本研究显示，牙龈卟啉单胞菌培养上清液中分离出的牙龈蛋白酶可引发HCO凋亡，提示牙龈蛋白酶也可引发人成骨细胞凋亡，但确切分子机制仍需进一步研究。

整合素α5、β1蛋白分布于细胞表面，胞内域与信号传递因子结合，胞外域与胞外基质相连，共同调控细胞内外的信号传递，调节细胞增殖、分化等过程。相关研究显示，整合素α5、β1可抑制Bim的促失巢凋亡过程，其表达水平降低会促进失巢凋亡〔6〕。牙龈蛋白酶通过水解宿主细胞黏附因子，分离细胞与胞外基质，诱发细胞凋亡，是其介导牙龈细胞凋亡的主要机制之一。本研究显示，牙龈蛋白酶呈剂量依赖性和时间依赖性下调整合素α5、β1表达，0.3 mmol/L的PI3K-AKT信号通路抑制剂LY294002可有效抑制牙龈蛋白酶诱导的整合素α5、β1低表达，提示牙龈蛋白酶在水解宿主细胞来诱导凋亡之外，还可通过PI3K-AKT信号通路下调整合素α5、β1表达来诱导人成骨细胞凋亡。本研究中还发现，整合素β1蛋白表达降低程度较α5明显，即使在牙龈蛋白酶活血逐渐消退的后期，整合素α5表达水平不再明显改变，β1表达水平仍低于α5。相关研究显示，在牙龈成纤维细胞、上皮细胞中均存在整合素β1明显改变，说明其在细胞正常生命周期调控中发挥更明显的主导作用。

4 参考文献

1吴 贇，陈 凌，汪义永，等.牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人主动脉内皮细胞IL-10和MCP-1表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(22)：6414-6.

2叶 洁.炎性刺激下张应力对成骨细胞Runx2/Cbfa1表达影响〔D〕.温州：温州医学院，2011.

3廖雪峰.盐酸米诺环素软膏联合甲硝唑缓释药膜治疗慢性牙周炎的疗效观察〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(2)：229-32.

4黄剑锋.钙通道阻滞剂所致牙龈增生患者牙周综合干预前后牙龈炎症及菌斑指数变化分析〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(5)：507-8，510.

5陈亚琼.口腔鳞癌术后组织中细胞纤毛转运蛋白20、Furin和上皮型黏附素的表达及意义〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(13)：3638-40.

6包晨刚.影响微种植钉支抗的临床稳定性因素研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(5)：637-9.