运动干预延缓骨骼肌衰老的作用及机制

张丽丽

(湖州师范学院，浙江 湖州 313000)

随着年龄增加，骨骼肌结构和功能会发生退行性变化，加速了心血管、神经、内分泌系统及其他组织器官的衰老〔1〕。因此，从骨骼肌衰老问题着手缓解整个机体衰老具有重要意义。研究发现，将中青年大鼠GDF11蛋白基因敲除后骨骼肌出现类似衰老大鼠的特征〔2〕，提示GDF11蛋白与骨骼肌衰老存在关联。研究已证实，骨骼肌减少具有可训练性〔3〕，但其内在机制仍需探讨，运动训练与老龄骨骼肌组织中GDF11蛋白表达的相关性鲜有报道。本次研究探索不同参数的间隙式负重运动对老龄骨骼肌衰老的影响，并分析与骨骼肌组织中GDF11蛋白表达的相关性，探讨运动干预骨骼肌减少的可能机制。

1 材料与方法

1.1动物与分组 SPF级雄性Wistar大鼠24只，17月龄，体重(450±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。温度(24±2)℃、相对湿度40%～60%条件下分笼喂养，4只/笼，自由饮水。适应性喂养1 w后称量体重，随机数字法分对照组(不进行任何运动干预)、低负重组、中等负重组、高负重组，每组6只。

1.2训练方法 首先进行无负重适应性训练7 d，各运动组大鼠参加，跑台速度设定为10 m/min，30 min/d，坡度0°。之后进行负重适应性训练7 d，各运动组大鼠参加，跑台设置与无负重适应性训练相同，30 min/d，在腰背部捆绑条形负荷，负重为最大负重强度的10%；最大负重强度获取方法：逐渐在大鼠腰背部增加重量，到无法正常行走为止。正式负重训练：各运动组大鼠进行为期8 w的负重训练，低负重组(40%最大负重)、中等负重组(60%最大负重)、高负重组(70%最大负重)，跑台速度设定为15 m/min，坡度0°，跑3 min、休息3 min，每次共训练6组，1次/d，周日休息。

1.3标本采集与处理 正式负重第8周结束后，大鼠禁食、禁水12 h，称重后取股直肌组织标本。腹腔注射50 mg/kg剂量的1%戊巴比妥钠全麻后，取左侧中段股直肌为骨骼肌标本，剔去周围脂肪，4℃蒸馏水中洗净，液氮冻干，-80℃保存待测。

1.4骨骼肌形态学观察及匀浆指标测定 取部分骨骼肌组织，冷冻切片，常规行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察切片，分析各组大鼠骨骼肌形态学改变。分别取各组大鼠骨骼肌组织300 mg，匀浆后使用脂褐质检测试剂盒(荧光比色法)测定脂褐质含量，使用钙检测试剂盒(甲基麝香草酚蓝比色法)测定组织中钙含量，上述操作均按试剂盒说明进行。

1.5Western印迹检测骨骼肌组织中GDF11蛋白表达 分别取各组冷冻骨骼肌组织20 mg，加RIPA蛋白裂解液后冰上匀浆，离心取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒检测抽提蛋白的浓度；行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，将靶向蛋白湿法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，滴加GDF11单抗隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜，滴加HRP标记的二抗(1∶1 000)，室温下孵育3 h，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒处理，电化学发光(ECL)显色液曝光，凝胶成像系统拍照，以β-actin为内参，分析各条带灰度值。

1.6统计学分析 采用SPSS20.0软件行t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠行为表现及体重变化 大鼠实验前精神状态良好，饮水、饮食积极；训练初期各负重组大鼠饮水、饮食积极性欠佳，随着时间延长逐渐增加，最终明显高于对照组；中等及高负重组大鼠训练间隙和训练后均表现出程度不同的疲劳现象，但次日训练时均已恢复正常，低负重组大鼠疲劳现象不明显。运动后，各负重组大鼠精神状态明显优于对照组，表现为对外界刺激反应灵敏度更高，自主活动较多。训练前各组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)；经6 w训练后各负重组大鼠体重均明显低于训练前和对照组(P<0.05)，其中以高负重组最明显。见表1。

表1 各组大鼠训练前后体重比较

与训练前相比:1)P<0.05；与对照组相比:2)P<0.01

2.2各组大鼠骨骼肌组织形态学变化 HE染色显示，各组大鼠骨骼肌纤维组织均出现不同程度的圆形化，细胞排列错乱且大小不一，细胞间隙增大，可见白色组织填充；其中以对照组大鼠最明显，高负重组次之，低、中负重组较另外两组细胞排列更紧密；中、高负重组大鼠部分肌细胞的直径较大。见图1。

图1 各组大鼠骨骼肌组织形态(HE，×400)

2.3各组大鼠骨骼肌匀浆脂褐质及钙浓度水平比较 对照组与高负重组、低负重组与中等负重组之间脂褐质浓度比较差异均无统计学意义(P>0.05)；低负重组与中等负重组的脂褐质浓度明显低于对照组与高负重组(P<0.05)。各负重组大鼠骨骼肌中钙浓度均明显高于对照组(P<0.05)，其中以低负重组钙离子浓度升高最明显。见表2。

表2 6 w训练后各组大鼠骨骼肌匀浆脂褐质及钙浓度水平比较

与对照组相比：1)P<0.01

2.4各组大鼠骨骼肌GDF11蛋白表达情况 对照组、低负重组、中等负重组、高负重组大鼠骨骼肌GDF11蛋白相对表达量分别为2.61±0.58、4.70±0.81、4.53±0.69、2.45±0.86，其中对照组与高负重组、低负重组与中等负重组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；低负重组与中等负重组GDF11蛋白表达水平明显高于对照组和高负重组(P<0.01)。见图2。

图2 各组大鼠骨骼肌GDF11蛋白Western印迹电泳图

3 讨 论

相关研究发现，间隙运动对心肌具有保护作用，还可促进骨骼肌能量供应〔4〕。考虑到本实验中使用的老龄大鼠心肺功能存在衰退，故选用跑3 min、休息3 min的间隙训练方式；同时经预实验确定大鼠最大负重水平，并分别给予40%、60%、70%最大负重反映不同负荷强度。运动前后对大鼠行为表现观察显示，间隙负重运动干预可缓解自然衰老进程，增强神经肌肉功能活性水平，其中低负重组大鼠改善更明显，提示40%最大负重是老年大鼠较为合适的运动刺激。

正常衰老过程中，体内细胞需对抗自由基损伤、病原菌入侵等各种外界刺激；细胞膜为第一道屏障〔5〕。本次研究中老年大鼠骨骼肌纤维组织出现了不同程度的圆形化，可能为细胞膜受外界刺激导致的结果；细胞间隙增大，有白色组织填充可能为老龄骨骼肌中积累的脂肪填充效果。经间隙负重运动干预后，低负重组和中等负重组大鼠骨骼肌纤维组织圆形化程度明显降低，细胞排列更紧密，提示骨骼肌细胞间隙脂肪含量明显降低，且未对肌纤维组织造成过度损伤，延缓了正常衰老进程；而高负重组肌细胞间隙脂肪含量增多，可能由于运动强度过大对骨骼肌细胞造成了损伤；此外，中、高负重组大鼠肌细胞直径变大，说明该运动强度可刺激部分肌纤维增粗。

脂褐质是体内不饱和脂肪酸对抗自由基损伤时生成的产物，可作为反映组织衰老的标志物〔6〕。本实验结果提示40%和60%最大负荷量间隙运动可促进骨骼肌内自由基清除速率，进而降低脂褐质水平，延缓骨骼肌衰老；而70%负荷间隙运动属于超负荷，对骨骼肌自由基代谢产生了负面影响。钙是骨骼肌活动的主要耦联因子，微量的钙元素由胞外流入胞内即可对骨骼肌纤维产生明显影响〔7〕。老龄大鼠因肌肉自身结构改变引发胞内钙亏空，对胞外钙的依赖性更高，若未得到有效补充，会加速肌肉衰退〔8〕。本实验显示，各负重组骨骼肌中钙浓度均明显高于对照组。说明负重间隙运动可动员更多胞外钙，刺激机体为骨骼肌分配更多的钙量来保证较好的运动功能，延缓骨骼肌衰老。GDF11蛋白是胞外钙流入胞内的重要调控蛋白之一，可促进胞外钙内流；同时GDF11蛋白对维持骨骼肌正常解剖结构具有重要意义。本实验显示，低、中等负重组GDF11蛋白水平明显高于高负重组和对照组，可能与低、中负重强度的运动刺激对老年大鼠较适宜，可直接或间接诱发骨骼肌组织中GDF11蛋白增多；同时还可负向影响骨骼肌收缩机制，导致GDF11蛋白代谢减慢。

4 参考文献

1夏 志，赵 艳，尚画雨，等.衰老个体骨骼肌蛋白质代谢相关问题〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(14)：3604-7.

2樊申元，靳二辉.PI3K/Akt/mTOR信号通路对自然衰老小鼠骨骼肌自噬的影响及不同运动方式的调控〔J〕.沈阳体育学院学报，2016；35(1)：82-6，92.

3Egerman MA，Cadena SM，Gilbert JA,etal.GDF11 increases with age and inhibits skeletal muscle regeneration〔J〕.Cell Metab，2015；22(1)：164-74.

4赵丽霞，李 蓉，熊东林，等.人骨骼肌成肌细胞体外分化的全程观察及INK4a信号通路对其衰老的诱导研究〔J〕.中华实验外科杂志，2013；30(7)：1383-6.

5马 波，陈忠诚.肝纤维化组织中抗衰老蛋白及抗增殖蛋白的表达及其作用机制〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(20)：4978-80.

6杜少辉，李文惠，闫万军，等.骨骼肌衰老与力量-速度的关系〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2011；15(7)：1273-6.

7苗小宝，孟昭琴，王美乐，等.补充天然虾青素和递增游泳对力竭运动大鼠骨骼肌自由基代谢的影响〔J〕.当代体育科技，2016；6(35)：25-7.

8刘丰彬.综合干预对D-半乳糖衰老大鼠骨骼肌自由基和激素代谢影响的研究〔J〕.大连大学学报，2017；38(3)：75-81，85.