叉头框蛋白E1对肝癌细胞侵袭及迁移能力的影响

张 雯 姚豫桐

(四川省医学科学院 四川省人民医院肝胆胰脾&细胞移植中心，四川 成都 610072)

超过80%的肝癌患者在确诊时已经处于癌症晚期，治疗后5年内生存率低于3%〔1，2〕。肝癌易转移、易复发是肝癌致死的重要原因，探究肝癌的发病机制，寻找有效方法提高肝癌患者的生存期是重中之重〔3〕。叉头框蛋白(FOX)E1属于FOX家族的成员，在胚胎发育、分化等过程中发挥关键作用，研究报道，FOXE1在基底细胞癌、甲状腺癌、皮肤鳞癌等中异常表达，并且在癌细胞的发展和转移中发挥决定性作用〔4～6〕。FOXE1在肝癌中表达异常下调，而对于其在肝癌细胞侵袭和迁移中的作用尚不清楚〔7〕。本实验对FOXE1在体外肝癌细胞侵袭和迁移中的作用进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1材料 肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝细胞HL7702购自中科院细胞库；FOXE1 pcDNA3.1购自美国OriGene；FOXE1、β-actin引物均由上海生工合成；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Pierce；电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Amersham Biosceiences；胎牛血清购自美国Biochrom；DMEM购自美国Sigma；FOXE1抗体购自美国Bioworld；反转录试剂盒购自大连TaKaRa；qRT-PCR试剂盒购自南京Vazyme；Lipofectamine2000购自美国 invitrogen；基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、神经钙黏素(N-cadherin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、上皮钙黏附素(E-cadherin)抗体购自美国CTS。

1.2qRT-PCR测定FOXE1在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达 取人肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝细胞HL7702，提取细胞中的RNA，用核酸蛋白仪分析A260/A280的比值1.8～2.0。逆转录合成cDNA，合成产物保存在-20℃。qRT-PCR测定FOXE1水平。引物：FOXE1-正义链：5′-GACCACGGTGGACTTCTAGCG-3′，FOXE1-反义链：5′-CCCTAC-GCTGGCTCACAT-3′。β-actin-正义链：5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，β-actin-反义链：5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。以β-actin为内参，根据PCR反应曲线得出阈值循环数，分析Ct值，用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

1.3Western印迹测定FOXE1在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达 取人肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和人正常肝细胞HL7702，在冰上提取细胞蛋白，步骤参照细胞蛋白提取试剂盒。用BCA法对蛋白定量。按照每组40 μg蛋白样品进行蛋白电泳。在上样前，将蛋白样品与上样缓冲液混合煮沸5 min后，放在冰上备用。30 mA电流电泳，观察染料进入到分离胶和浓缩胶的交界处以后，把电流调整到20 mA，直到染料进入到分离胶的底部以后，将凝胶取出，进行转膜(转膜电泳用250 mA，转膜时间为2 h)、封闭(5%脱脂奶粉，室温，封闭1 h)。取出膜，与按照1∶800稀释的FOXE1一抗在4℃过夜以后，再与1∶2 000稀释的二抗在室温反应2 h。用ECL显色，曝光后，用Image J分析条带的灰度值。FOXE1蛋白水平=FOXE1灰度值/β-actin灰度值。

1.4细胞转染和分组 用Lipofectamine2000将FOXE1 pcDNA3.1和空载体pcDNA3.1转染到HCCLM3细胞中，步骤参照Lipofectamine2000转染试剂说明书，将转染后的细胞依次命名为FOXE1组和Vector组，并且以不做转染的细胞命名为WT组，在转染后的24 h，分别用qRT-PCR和Western印迹测定各组细胞中的FOXE1转录和表达水平，步骤同上。

1.5细胞划痕实验测定细胞迁移 WT、FOXE1、Vector组细胞在转染后，用细胞培养液把细胞浓度调整为每毫升含有1×106个细胞，接种到6孔板中，每孔中添加1 ml的细胞悬液，培养过夜以后，观察细胞长满底部以后，用无菌的移液枪枪头在底部划出一条细痕，用PBS把划下的细胞去除以后，每孔添加2 ml的细胞悬浮液，继续培养24 h。测量0 h和24 h细胞划痕的宽度，计算细胞迁移率。迁移率=100%×(0 h细胞划痕的宽度-24 h细胞划痕的宽度)/0 h细胞划痕的宽度。

1.6Transwell小室测定细胞侵袭 WT、FOXE1、Vector细胞在转染后用Transwell小室测定细胞侵袭能力。用不含血清的培养液把各组细胞制成单细胞悬浮液，密度为1×106个/ml。在侵袭实验前30 min，用基质胶湿化Transwell小室。把上述100 μl细胞悬浮液加入到Transwell小室的上室，在下室中添加600 μl的含10%胎牛血清的细胞培养液。孵育24 h以后，用甲醇固定10 min，结晶紫染色20 min，在显微镜下观察细胞侵袭个数。

1.7Western印迹测定MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平 WT、FOXE1、Vector细胞在转染后继续培养24 h，Western印迹方法测定细胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平，步骤同上。

1.8统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1FOXE1在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达 肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3中FOXE1 mRNA和蛋白水平均明显低于正常肝细胞HL7702，差异具有统计学意义(P<0.05)。HCCLM3细胞中的FOXE1 mRNA和蛋白水平明显低于HepG2细胞和SMCC7721细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。FOXE1在肝癌细胞中低表达，且在HCCLM3细胞中的表达水平最低，选用HCCLM3细胞做后续实验。见图1和表1。

图1 Western印迹测定肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝细胞HL7702中FOXE1蛋白水平

表1 肝癌细胞SMCC7721、HepG2、HCCLM3和正常肝细胞HL7702中FOXE1 mRNA和蛋白表达水平比较

与HL7702相比：1)P<0.05；与HCCLM3相比：2)P<0.05

2.2FOXE1在转染后细胞中的表达 FOXE1组FOXE1 mRNA和蛋白水平均明显高于WT组，差异具有统计学意义(P<0.05)。Vector组FOXE1 mRNA和蛋白水平与WT相比差异无统计学意义(P>0.05)。FOXE1过表达载体可以促进肝癌细胞中的FOXE1的转录和表达。见图2和表2。

图2 Western印迹测定转染后的HCCLM3细胞中FOXE1蛋白水平

表2 各组细胞中FOXE1 mRNA和蛋白表达水平比较

与WT相比：1)P<0.05，下表同

2.3FOXE1对肝癌细胞侵袭及迁移影响 FOXE1组细胞迁移率和侵袭细胞数目均明显低于WT组，差异具有统计学意义(P<0.05)。Vector组细胞迁移率和侵袭细胞数目与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)。FOXE1过表达载体可以降低肝癌细胞的侵袭和迁移能力。见表3。

表3 各组细胞迁移率和侵袭细胞数目比较

2.4FOXE1对肝癌细胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表达影响 FOXE1组MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白水平均明显低于WT组，而E-cadherin水平明显高于WT组，差异具有统计学意义(P<0.05)。Vector组MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)。FOXE1过表达载体可以促进肝癌细胞中E-cadherin表达，抑制细胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。见图3和表4。

图3 Western印迹测定MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表达

表4 各组细胞中MMP-2、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白水平比较

3 讨 论

叉头框家族是一个十分庞大的转录因子家族，其成员都含有一个典型的叉头区域，该蛋白家族能够影响细胞的生长、分化等多种生物学功能，与肿瘤的转移有关〔8〕。FOXE1是叉头框家族成员之一，最初发现其可以调控甲状腺的生长，是一种重要的甲状腺转录因子，能够影响甲状腺滤泡细胞的生长〔9〕。研究表明，FOXE1在肿瘤中表达异常，并且与肿瘤的恶性程度有关，目前发现的与FOXE1有关的恶性肿瘤主要有结直肠癌、胰腺癌、白血病、大肠癌等〔10～13〕。在大肠癌中提高FOXE1的表达后，大肠癌细胞的恶性程度降低，细胞侵袭能力下降〔13〕。周宇帆〔7〕检测了肝癌细胞中FOXE1 mRNA水平发现，FOXE1 mRNA在肝癌中低表达，并且其表达水平的高低与肝癌血管侵犯、包膜侵犯等有关。

肿瘤转移大致分为4步：首先肿瘤从原发部位脱落以后穿过基底膜进入到间质中；其次，肿瘤细胞通过在间质中的移行到达脉管周围；第三，肿瘤穿过血管内皮组织进入到血液中；第四，肿瘤细胞穿过血管，进入到新的组织中，增殖形成新的病灶〔14～16〕。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞降解细胞外基质是关键步骤，细胞外基质的主要成分为Ⅳ型胶原酶，因此，Ⅳ型胶原酶也是阻碍肿瘤细胞转移的重要屏障。MMPs是细胞外基质降解的主要蛋白酶，其中MMP-2是目前发现的降解Ⅳ型胶原酶的主要蛋白酶，其可以打破外基质的降解平衡，诱导肿瘤细胞穿过组织屏障向邻近组织转移〔17，18〕。肿瘤细胞转移过程中其上皮细胞特征逐渐减弱，间质细胞特征逐渐明显，这被称之为上皮间质转化(EMT)，E-cadherin是上皮细胞的标志物，而N-cadherin、Vimentin是间质细胞的标志物，其在肝癌中异常表达〔19，20〕。

本实验说明FOXE1在肝癌细胞中表达降低，FOXE1可以降低肝癌细胞降解细胞外基质的能力，降低肝癌细胞的侵袭和迁移能力，抑制肝癌细胞EMT，FOXE1可能在肝癌中发挥抑癌基因的作用。

FOXE1在多种肿瘤中异常表达，并且可以影响肿瘤细胞的多种生物学特性，而本实验证明，FOXE1可能作为一种抑癌基因参与肝癌转移，FOXE1可以降低肝癌细胞的侵袭和迁移能力，抑制肝癌细胞EMT，其具体的作用机制需要在以后的实验中进行探讨，这对于今后研究肝癌的发病机制具有重要意义。

4 参考文献

1Kudo M，Matsui O，Izumi N，etal.JSH consensus-based clinical practice guidelines for the management of hepatocellular carcinoma：2014 update by the liver cancer study group of Japan〔J〕.Liver Cancer，2014;3(3-4)：458-68.

2Yoshimoto S，Loo TM，Atarashi K，etal.Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome〔J〕.Nature，2013;499(7456)：97-101.

3Pediconi N，Lupacchini L，Salerno D，etal.SAT-424-EZH2 methyltransferase and JMJD3/UTX demethylases are involved in hepatocytic differentiation and liver cancer cells plasticity〔J〕.J Hepatol，2017;66(1)：S644-5.

4Tomaz RA，Sousa I，Silva JG，etal.FOXE1 polymorphisms are associated with familial and sporadic nonmedullary thyroid cancer susceptibility〔J〕.Clin Endocrinol，2012;77(6)：926-33.

5Eichberger T，Regl G，Ikram MS，etal.FOXE1，a new transcriptional target of GLI2 is expressed in human epidermis and basal cell carcinoma〔J〕.J Invest Dermatol，2004;122(5)：1180-7.

6Venza I，Visalli M，Tripodo B，etal.FOXE1 is a target for aberrant methylation in cutaneous squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Dermatol，2010;162(5)：1093-7.

7周宇帆.FOXC2 和 FOXEl 在原发性肝细胞癌中的表达及临床意义〔D〕.长沙：中南大学，2013.

8张锦锦，唐 慧.叉头框 Q1 基因调控肿瘤发生和发展的研究进展〔J〕.肿瘤，2017;37(2)：177-83.

9Jiang W，Zheng L，Xu L，etal.Association between FOXP3，FOXE1 gene polymorphisms and risk of differentiated thyroid cancer in Chinese Han population〔J〕.Mol Biol，2015;4(3)：1-5.

10龙亚东.FOXE-1 甲基化与表达的关联分析及其与结直肠癌的相关性研究〔D〕.上海：复旦大学，2013.

11Sato N，Fukushima N，Maitra A，etal.Discovery of novel targets for aberrant methylation in pancreatic carcinoma using high-throughput microarrays〔J〕.Cancer Res，2003;63(13)：3735-42.

12Rush LJ，Raval A，Funchain P，etal.Epigenetic profiling in chronic lymphocytic leukemia reveals novel methylation targets〔J〕.Cancer Res，2004;64(7)：2424-33.

13黄钟庭.FOXE1在大肠癌中的表达及其功能研究〔D〕.杭州：浙江大学，2014.

14胡伟国，林金叶，宋启斌.炎症小体与肿瘤转移关系的研究进展〔J〕.肿瘤学杂志，2016;22(2)：99-105.

15刘 华，杨贵义，钦传辉.槐耳清膏对手术切除结肠癌后肿瘤复发及转移的影响及其机制研究〔J〕.现代中西医结合杂志，2016;25(9)：968-70.

16Zhuang HH，Xue W，Ping W.Transcription factor cAMP response element binding protein mediates tumor metastasis and the related molecular mechanism〔J〕.Acta Anat Sin，2015;46(1)：138-44.

17Shi F，Xiao F，Ding P，etal.Long noncoding RNA highly up-regulated in liver cancer predicts unfavorable outcome and regulates metastasis by MMPs in triple-negative breast cancer〔J〕.Arch Med Res，2016;47(6)：446-53.

18Li X，Wu JF.Recent developments in patent anti-cancer agents targeting the matrix metalloproteinases (MMPs)〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2010;5(2)：109-41.

19Zhang J，Guo Y.The expression of N-cadherin and vimentin in rectum adenocarcinoma and their clinical value〔J〕.Chongqing Med，2014;43(8)：935-4.

20Bhat FA，Sharmila G，Balakrishnan S，etal.Quercetin reverses EGF-induced epithelial to mesenchymal transition and invasiveness in prostate cancer (PC-3) cell line via EGFR/PI3K/Akt pathway〔J〕.J Nutr Biochem，2014;25(11)：1132-9.