美托洛尔对陈旧性心肌梗死大鼠心脏Cx43与p-Cx43表达的影响

王鸿超 卢 炜 张少娟 谢亚囡 李 芳 刘金明

(河北医科大学第二医院心血管内科，河北 石家庄 050000)

急性冠状动脉综合征(ACS)是一种内科常见临床综合征，常表现为心力衰竭、心律失常、心源性休克及猝死现象。随着溶栓和经皮冠状动脉介入术(PCI)等治疗措施的广泛实施，心肌梗死的即刻死亡率显著下降，然而心力衰竭的发生率和远期死亡的风险并未改变。同时，陈旧性心肌梗死(OMI)患者也就越来越多，其并发的心力衰竭或心律失常是临床最常见的死亡原因之一〔1〕。由缝隙连接蛋白(Cx)家族组成的缝隙连接通道在心肌细胞之间的耦合在心脏电冲动传导中具有重要作用，其中Cx43是重要成员之一，其表达水平及其磷酸化状态(p-Cx43)被证实与心电生理重构和心律失常的发生密切相关〔2〕。美托洛尔是一种亲脂性β1-受体阻滞剂药物，可显著抑制肾上腺素能受体与交感神经传出，其预防心肌梗死后心律失常的作用已得到证实〔3〕。本研究探讨在不同美托洛尔干预剂量下，对OMI大鼠心脏Cx43与p-Cx43表达水平的影响，旨在探讨美托洛尔预防心律失常的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 清洁级Wistar大鼠80只，体重190～230 g，平均(210±15)g，购于中国医学科学院医学实验动物研究所。采用随机数字表法将Wistar大鼠分为假手术组、心肌梗死组、实验1组和实验2组，每组20只。

1.2主要试剂与仪器 RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；全蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术研究所)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(康肽生物科技北京有限公司)；Western 一抗稀释液(碧云天生物技术研究所)；Western 二抗稀释液(碧云天生物技术研究所)；兔抗鼠Cx43单克隆抗体(美国Epitomics公司)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)检测试剂盒(上海铭博生物科技有限公司)；其他试剂均为分析纯国产试剂。RT-PCR仪(美国BIO-RAD公司)，电生理刺激仪(苏州市东方电子仪器厂)，酶标仪(上海安亭科学仪器厂)，双垂直蛋白电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.3心肌梗死模型的构建 手术前12 h禁食不禁水，麻醉(10%水合氯醛)，大鼠取仰卧位，连接多道生理信号采集处理系统，行心电图监测。于颈部正中切开气管连接动物人工呼吸机。备皮、碘胺酮消毒铺巾，在胸骨左缘扪和心脏搏动处剪开皮肤，于胸骨左缘3、4肋处切开胸廓，剪开心包。于肺动脉圆锥与左心耳下缘间距主动脉根部约3 mm处，用眼科无创缝合针结扎左冠状动脉前降支深部，观察心电图动态变化，造模成功的标准为肢体导联发生ST段弓背向上抬高0.2 mV以上且持续超过30 min。术后缝合皮肤，肌肉注射青霉素80万单位2～3 d。心肌梗死组、实验1组和实验2组构建心肌梗死模型；假手术组不结扎冠状动脉，其余操作相同。

1.4给药 实验1组和实验2组分别于建模成功24 h后以灌胃酒石酸美托洛尔(广州白云山天心制药股份有限公司，国药准字H20030018)10.0 mg/kg和15 mg/kg。假手术组和心肌梗死组灌胃等量蒸馏水，每天灌胃1次，连续30 d。

1.5检测指标

1.5.1血清心肌坏死标志物 术后6 h，取假手术组和心肌梗死组各动脉血2 ml，离心提取上清后，于全自动生化分析仪检测LDH和CK水平。

1.5.2心室颤动阈值检测 术后30 d，取所有组别大鼠，开胸暴露心脏，于前室间沟心尖部位，刺入双极起搏电极2 mm，采用电生理刺激仪施加起搏脉宽10 ms、电压5 V的S1S1分级递增刺激。心室颤动阈值定义为引发心室颤动并且致死的最低刺激频率。

1.5.3Western印迹检测心肌组织Cx43和p-Cx43蛋白表达水平 取完成心室颤动阈值检测的大鼠完整心脏，剪刀切碎，用预冷的组织裂解液提取大鼠心肌组织总蛋白，Bradford法测定样品的蛋白含量，12%的凝胶分离蛋白质，利用转膜仪(湿转)在100 V 1.5 h的条件下将凝胶上的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后与稀释的Cx43和p-Cx43单克隆抗体(1∶1 000)过夜结合，洗模后加入稀释的二抗，室温孵育60 min，BeyoECL Plus显色，凝胶成像和化学发光分析系统收集显色条带，运用 Quantity One 软件进行蛋白条带数据分析。

2 结 果

2.1大鼠心肌梗死模型的建立 建模30 d后，假手术组大鼠心肌组织形态正常，心肌梗死组大鼠心肌细胞凝固性坏死，形成红染，核固缩(见图1)。心肌梗死组血清LDH和CK水平显著高于假手术组(P<0.05)，见表1。

图1 建模30 d后两组大鼠心肌组织形态学改变(×200)

表1 两组心肌组织LDH和CK水平

2.2心室颤动阈值 心肌梗死组〔(319.63±89.56)次/min〕、实验1组〔(378.89±92.35)次/min〕和实验2组〔(410.32±102.57)次/min〕大鼠心室颤动阈值均显著低于假手术组〔(526.78±135.15)次/min〕(P<0.05)；实验1组和实验2组大鼠心室颤动阈值均显著高于心肌梗死组(P<0.05)，且实验2组显著高于实验1组(P<0.05)。

2.3心肌组织Cx43和p-Cx43蛋白表达水平 心肌梗死组大鼠心肌组织p-Cx43和P-Cx43/Cx43显著低于假手术组(P<0.05)；实验1组和实验2组大鼠心肌组织p-Cx43和P-Cx43/Cx43显著高于假手术组(P<0.05)；实验1组和实验2组大鼠心肌组织p-Cx43和Cx43/p-Cx4均显著高于心肌梗死组(P<0.05)，且实验2组显著高于实验1组(P<0.05)。各组大鼠心肌组织Cx43蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织Cx43和p-Cx43蛋白表达水平比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与心肌梗死组比较：2)P<0.05；与实验1组比较：3)P<0.05

3 讨 论

心脏缝隙连接(GJ)具有低选择性、低电阻和亲水性的特点，是心肌细胞化学信息传递、电耦联和化学耦联的基础，主要由缝隙连接蛋白组成，分为Cx40、Cx43和Cx45三种形式，其中心室肌主要表达Cx43〔4，5〕。当发生心肌缺血-再灌注、心力衰竭或糖尿病等时可导致心肌细胞缝隙连接发生重塑。现已证明，Cx43是心肌细胞和心室肌细胞之间的主要连接蛋白，其表达水平与心室内的传导速度密切相关〔6，7〕。本研究结果显示，心肌梗死后大鼠心室颤动阈值降低。经Western印迹检测结果证实，心肌梗死后Cx43表达水平无明显差异，而其磷酸化状态p-Cx43表达下调。心肌细胞中GJ连接蛋白之间的通道特性和聚集与连接蛋白的磷酸化状态紧密相关。有研究显示，Cx43的去磷酸化可影响细胞之间电耦联，导致传导异常和折返性心律异常的发生，这与细胞内部的ATP水解存在一定相关性〔8〕。因此，p-Cx43参与缝隙连接通讯功能的调节过程，包括缝隙连接蛋白的组装、运输、降解、分解、低聚反应和门控功能等，从而影响正常由Cx43介导的细胞缝隙连接通讯功能〔9〕。心肌梗死后Cx43的去磷酸化被证实是导致心电传导速率下降、心电生理重构和形成折返性心律失常的原因之一〔10〕。本研究表明美托洛尔可显著提高心肌梗死大鼠心室颤动阈值，这可能与p-Cx43蛋白表达水平提高相关。既往研究显示，美托洛尔不但可抑制房室结的传输，延长房室传导时间，而且能够提高膜的稳定性〔11〕。临床上，美托洛尔常被用于预防心肌梗死后心律失常的发生。作为一种β1受体阻滞剂，本研究证实美托洛尔可能参与了Cx43的磷酸化过程，提高了p-Cx43蛋白表达水平，且呈剂量依赖性。p-Cx43蛋白表达水平的提高从而有助于逆转心肌缺血介导的心电传导异常〔12，13〕。

4 参考文献

1陈 刚，黄 婷，杨 锴.碎裂QRS波与陈旧性心肌梗死患者预后的关系〔J〕.广东医学，2014；35(15)：2385-7.

2邬 涛.厄贝沙坦对心肌缺血大鼠室性心律失常发生及缝隙连接蛋白 Cx43 表达影响的研究〔D〕.南昌：南昌大学，2016.

3Akin，H，etal.Comparison of the effects of metoprolol or carvedilol on serum gamma-glutamyltransferase and uric acid levels among patients with acute coronary syndrome without ST segment elevation〔J〕.Anatolian J Cardiol，2016；16(1)：16-22.

4Gupta A.Connexin43 Gap Junctions Influences Osteoblast Signalling and Enhances Osteoarthritis Gene Expression〔J〕.J Clin Exp Orthop，2016；2(2):1-2.

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6Gago-Fuentes R，Carpintero-Fernandez P，Goldring MB，etal.Biochemical evidence for gap junctions and Cx43 expression in immortalized human chondrocyte cell line：a potential model in the study of cell communication in human chondrocytes〔J〕.Osteoarth Cartil，2014；22(4)：586-90.

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8龚一萍，沈炜毅.基于 Cx43 磷酸化信号通路介导复脉汤对缺血性心律失常的保护作用〔J〕.辽宁中医药大学学报，2015；17(8)：5-7.

9Ribeiro-Rodrigues TM，Catarino S，Marques C，etal.AMSH-mediated deubiquitination of Cx43 regulates internalization and degradation of gap junctions〔J〕.FASEB J，2014；28(11)：4629-41.

10Gu Y，Wu G，Wang X，etal.Artemisinin prevents electric remodeling following myocardial infarction possibly by upregulating the expression of connexin 43〔J〕.Mol Med Rep，2014；10(4)：1851-6.

11范金涛，耿华培，毕丽丛，等.美托洛尔结合螺内酯治疗慢性心功能不全的疗效观察〔J〕.河北医药，2017；39(14)：2158-60.

12Lungkaphin A，Pongchaidecha A，Palee S，etal.Pinocembrin reduces cardiac arrhythmia and infarct size in rats subjected to acute myocardial ischemia/reperfusion〔J〕.App Physiol Nutr Metab，2015；40(10)：1031-7.

13Inthachai T，Lekawanvijit S，Kumfu S，etal.Dipeptidyl peptidase‐4 inhibitor improves cardiac function by attenuating adverse cardiac remodelling in rats with chronic myocardial infarction〔J〕.Experimental Physiol，2015；100(6)：667-79.