人参入血成分对过氧化氢损伤的心肌细胞的保护作用

朱 凯 张燚曼 冯 青 周 欢 吕宏亮 于智莘 李丽静

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

心力衰竭存在着心肌缺血现象，心肌缺血时一般会发生复杂的氧化应激反应，而氧自由基及其引起的脂质过氧化是造成心肌损伤的启动因素〔1〕。活性氧是一类在细胞呼吸及代谢过程中产生的氧的单电子还原产物，一方面具有信号转导和调控细胞活动等生理功能，另一方面过量的产生会引起生物大分子的过氧化反应，导致细胞结构及功能的破坏，造成细胞坏死或凋亡等不可逆性细胞损伤。过氧化氢(H2O2)是一种可以对心肌细胞造成损伤的活性氧(ROS)自由基。本文主要探讨人参入血成分对H2O2损伤的心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物及材料 新生24～72 h乳鼠，健康SPF级SD大鼠，体重180～220 g，雌雄各半，由辽宁省长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)-2015-0001。

1.2实验分组及给药 取新生72 h乳鼠心脏，将心肌组织进行消化，差速贴壁后，用台盼蓝排斥实验测定细胞活性。细胞活力>95%的细胞进行心肌细胞培养，观察细胞形态学特征和搏动情况。将细胞分为6组：(1)正常细胞组(Sham)：10%胎牛血清的DMEM；(2)H2O2损伤细胞组(H2O2)：含终浓度200 μmol/L H2O210%胎牛血清的DMEM；(3)人参入血成分含药血清5 min组(SFP 5 min)：含终浓度为200 μmol/L H2O2的10% 5 min含药血清的DMEM；(4)人参入血成分含药血清10 min组(SFP 10 min)：含终浓度为200 μmol/L H2O2的10% 10 min含药血清的DMEM；(5)入血成分2%组(SFY2%)：含终浓度为200 μmol/L H2O2的2%移行成分和10%胎牛血清的DMEM；(6)入血成分5%组(SFY5%)：含终浓度为200 μmol/L H2O2的5%移行成分和10%胎牛血清的DMEM。每孔加相应溶液200 μl，作用1 h后检测各项指标。

1.3检测指标 利用MTT和CCK-8法检测心肌细胞的存活率；利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，心肌细胞丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力；利用荧光探针检测心肌细胞内游离钙(〔Ca2+〕i)的含量。

1.4统计学方法 使用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及LSD检验。

2 结 果

2.1各组心肌细胞存活率比较 与Sham组对比，H2O2组细胞存活率明显下降(P<0.001);SFP 5 min组、SFP 10 min组、SFY2%组、SFY5%组心肌细胞存活率均显著高于H2O2组(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组心肌细胞存活率比较

与H2O2组比较:1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

2.2各组心肌细胞自主搏动频率比较 加药前，各组心肌细胞自主搏动频率差异均无统计学意义(均P>0.05)。加药1 h、6 h，H2O2组自主搏动频率均显著低于Sham组(均P<0.001)；SFP 5 min组、SFP 10 min组、SFY2%组、SFY5%组均显著高于H2O2组(P<0.05,P<0.001)。加药1 h，SFP 10 min组自主搏动频率显著低于SFP 5 min组(P<0.01)；SFY5%组显著高于SFY2%组(P<0.05)。见表2。

表2 各组心肌细胞自主搏动频率比较次/min)

与H2O2组比较：1)P<0.05，2)P<0.001；与SFP 5 min组比较：3)P<0.01；与SFY2%组比较：4)P<0.05

2.3各组LDH、MDA、SOD含量比较 与Sham组比较，H2O2组LDH和MDA含量明显升高(P<0.001)，SOD含量明显减少(P<0.001)。与H2O2组比较，SFP 5 min组、SFP 10 min组，SFY2%组、SFY5%组LDH、MDA含量显著降低(P<0.01,P<0.001),SOD含量显著升高(P<0.05,P<0.01)。见表3。

表3 各组心肌细胞LDH漏出量、MDA、SOD含量比较

与H2O2组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；与SFP 5 min组比较：4)P<0.01；与SFY2%组比较：5)P<0.05

2.4各组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Ca2+活性比较 与Sham组相比，H2O2组〔Ca2+〕i含量显著升高，Na+-K+-ATP酶、Ca2+ATP酶活力显著下降(P<0.001)；SFP 5 min组、SFP 10 min组、SFY2%组、SFY5%组〔Ca2+〕i含量均显著低于H2O2组，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性均显著高于H2O2组(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。SFP 10 min组〔Ca2+〕i显著高于SFP 5 min组，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活力均显著低于SFP 5 min组(P<0.05)。见表4。

表4 各组〔Ca2+〕i 、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性比较

与H2O2组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；与SFP 5 min组比较：4)P<0.05

3 讨 论

ROS指化学性质较活跃的含氧代谢物，是需氧细胞在有氧代谢过程中由氧分子(O2)或一氧化氮(NO)形成的副产物。ROS介导的氧化应激在心肌细胞凋亡过程中发挥重要作用。过量的ROS通过攻击脂质、蛋白质、核酸，破坏心肌细胞正常结构和功能，并促使线粒体渗透性转换孔开放，形成ROS激活与释放的正反馈回路从而导致再灌注性心律失常、心肌顿抑、细胞凋亡与坏死等〔2〕。H2O2本是一种重要的ROS，可在Fe2+或Cu2+的作用下或H2O2均裂产生HO·〔3〕。SOD是人体内的抗氧化酶系统之一，可以通过清除人体代谢中不断产生的自由基，保护机体组织免受过氧化及自由基的损伤。SOD的活力可反映机体清除氧自由基的能力，其活性与心肌损伤程度呈负相关。MDA是脂质过氧化代谢的毒性终产物，其含量可以直接反映体内脂质过氧化的强度和速率，间接反映细胞受氧自由基损害的严重程度，其含量与心肌损伤程度呈正相关〔4〕。维持心脏的正常功能需要大量的能量。能量代谢是心力衰竭发生、发展和恶化的重要因素之一。由于Ca2+参与心肌细胞的兴奋-收缩耦联，具有增强心肌收缩力的作用，因此细胞内钙超载也能造成细胞收缩功能紊乱，影响心肌正常生理活动和能量代谢，是心肌受损的主要机制之一。由此可见，抑制钙超载对保护心肌细胞至关重要〔5～7〕。辛伟等〔8〕报道，增加Ca2+-ATP酶活性可以改善心肌细胞舒张功能及能量代谢，降低细胞耗氧量，并减弱心肌重塑和凋亡。

4 参考文献

1吴青松.人端粒酶逆转录酶与Caspase-3 si-RNA构建永生化人肝细胞株〔D〕.广州：南方医科大学，2012.

2夏 强，钱令波.心脑缺血再灌注损伤的机制及防治策略研究进展〔J〕.浙江大学学报，2010；39(6)：551-7.

3Dhalla Ns，Elmoselhi AB，Hata T，etal.Status of myoeardial antioxidantsin isehemia-reperfusion injury〔J〕.Card Tol Res，2000；47(3)：446-56.

4黄志华，李良东，曾 靖，等.拳参正丁醇提取物对大鼠心肌肥厚时钠钾及钙ATP酶活性的影响〔J〕.时珍国医国药，2010；21(1)：122-3.

5胡元会，车维新，曹雪滨，等.心复康口服液对大鼠实验心衰模型心肌细胞Ca2+-ATPase及琥珀酸脱氢酶活性的影响〔J〕.中国医药学报，2000；15(2)：31-3.

6徐菲飞，彭 成，王茁伉，等.参附注射液对新生大鼠心肌细胞 ATP 酶及相关离子的影响〔J〕.中药药理与临床，2013；29(3)：19-21.

7罗明凤，张三印，黄秀深，等.参附注射液和生脉注射液对心肌细胞Ca2+-ATP酶影响的对比研究〔J〕.天津中医药，2008；25(6)：487-90

8辛 伟，李小鹰，鲁晓春，等.心肌肌浆网Ca2+-ATP酶过表达对慢性缺血性心力衰竭小型猪心功能的改善作用〔J〕.解放军医学杂志，2011；36(4)：347-51.