PTEN对急性T淋巴细胞白血病细胞增殖凋亡的影响

臧玉柱 于润红 白炎亮 李玉龙 陈玉清 张 茵 孙 恺

(河南省人民医院血液科，河南 郑州 450003)

急性T淋巴细胞白血病是白血病中较为常见的一种，目前尚没有特异性的治疗手段，患者经过造血干细胞移植和化疗后，5年的生存率仍然不高于40%〔1,2〕。第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)是一种具有磷酸酶活性的抑制癌症发生的基因，能够诱导多种癌细胞凋亡，对于癌细胞的生长、转移等也具有调控作用〔3,4〕。有研究表明，PTEN在白血病细胞中低表达，并且能够调控白血病细胞侵袭能力和血管新生能力〔5〕。本研究旨在探讨PTEN对急性T淋巴细胞白血病细胞生长和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 PTEN过表达载体(pEGFP-PTEN)和对照空载体(pEGFP)由河南省人民医院病理实验室构建并保存。PTEN、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。Lipofectamine2000为美国Invitrogen公司产品；胎牛血清、RPMI1640培养基均为美国Gibco公司产品；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒为美国Thermo公司产品；碘化丙啶(PI)、膜联蛋白(V-FITC)、噻唑蓝(MTT)、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)均为美国Sigma公司产品；PTEN单克隆抗体为美国millipore公司产品；β-连环蛋白(β-catenin)单克隆抗体、c-myc单克隆抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3单克隆抗体均为美国ABGENT公司产品。

1.2细胞培养 急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat购自中科院细胞库。将保存于液氮中的Jurkat细胞在37℃融化后，加入10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液，800 r/min离心10 min，吸除上清液，用3 ml的细胞培养液悬浮后，种植于细胞培养瓶中，在37℃，饱和湿度，5% CO2培养箱中培养。每隔3 d更换1次细胞培养液。

1.3细胞转染及分组 Jurkat细胞培养至对数期后，以2×105个细胞/ml种植到6孔板中，用Lipofectamine 2000转染试剂将pEGFP-PTEN和pEGFP转染至Jurkat细胞中，在转染前1 h用不含血清的细胞培养液培养细胞，以提高转染效率，转染pEGFP-PTEN和pEGFP的Jurkat细胞为pEGFP-PTEN组和pEGFP组，不做转染的Jurkat细胞为对照组。

1.4RT-PCR检测转染效果 3组细胞培养48 h后，收集细胞，按照每106个细胞加入1 ml Trizol裂解细胞。加入200 μl氯仿，充分混合，15 s后，静置3 min。4℃，12 000 r/min离心20 min。取400 μl上层水相溶液，加入500 μl异丙醇混合后，室温静置10 min。4℃，12 000 r/min离心20 min，吸除上清液，用75%乙醇溶液洗涤RNA沉淀2次后，用紫外分光光度计检测提取的RNA浓度及纯度(OD260/OD280介于1.8～2.0之间)。提取的RNA进行RT-PCR。程序为：第一阶段1个循环(95℃预变性2 min)，第二阶段共40个循环(95℃，15 s；60℃，1 min；72℃，2 min)，第三阶段1个循环(72℃总延伸5 min)。以2-△△Ct法计算PTEN mRNA水平，内参基因为GAPDH。PTEN上游引物5′-GGGGTGGAACTGTGCACTAA-3′，下游引物5′-TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG-3′。GAPDH上游引物5′-CGTCCTCGGATTCTCTGCTC-3′，下游引物5′-GCTGGTGCATTTTCGGTTGT-3′，实验重复3次，取均值。

1.5Western印迹检测转染效果 3组细胞培养48 h后，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入裂解液，超声2次，每次10 s，8 000 r/min离心10 min，吸取蛋白上清液，用BCA法对蛋白进行定量检测。配置10%分离胶和4%浓缩胶。将蛋白样品与上样缓冲液混合煮沸变性后，按照每孔50 μg的变性蛋白加入到上样孔中，90 V恒压电泳。135 mA转膜1 h。5%脱脂奶粉在室温封闭1 h后，进行一抗(1∶1 000倍稀释，4℃过夜)、二抗(1∶2 000倍稀释，室温1 h)孵育后，显色，显影后，用目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值表示目的蛋白水平，实验重复3次，取均值。

1.6MTT检测细胞增殖 3组细胞培养至对数期后，以每孔加入3 000个细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔中加入100 μl的细胞悬浮液，培养48 h后，每孔中加入20 μl MTT溶液，MTT浓度为5 mg/ml，在37℃孵育4 h。吸除上清液，加入150 μl二甲基亚砜溶液，反应10 min。酶标仪检测每孔490 nm的光密度值(OD值)，用不加细胞只加入等量细胞培养液的孔调零后，用转染后的细胞OD值占对照组细胞OD值百分比表示细胞存活率，每组设置5个复孔，实验重复3次，取均值。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡 3组细胞培养48 h后，收集106个细胞，用提前预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞2次后，加入结合缓冲液混合后，依次加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，在室温避光环境反应15 min，混匀后，加入200 μl结合缓冲液，在60 min内用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.8DCFH-DA法检测ROS水平 3组细胞培养48 h后，收集各组细胞，用400 μl PBS重悬细胞，加入2 μl DCFH-DA，在4℃孵育15 min后，检测其荧光强度，发射波长525 nm，激发波长488 nm，实验重复3次，取均值，以转染后的细胞荧光强度与对照组细胞荧光强度的比值表示ROS水平。

1.9Western印迹检测β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表达 3组细胞培养48 h后，提取细胞蛋白，Western印迹检测β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白水平，步骤参照1.5，实验重复3次，取均值。

1.10统计学处理 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1转染后细胞中PTEN表达 对照组和pEGFP组PTEN mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)，pEGFP-PTEN组均明显高于对照组(P<0.05)。见表1，图1。

图1 Western印迹检测转染后细胞中PTEN蛋白表达

表1 3组PTEN mRNA及蛋白表达水平比较

与对照组比较：1)P<0.05，下表同

2.2细胞增殖检测结果 对照组和pEGFP组细胞存活率〔(100.00±10.36)%，(100.15±11.97)%〕差异无统计学意义(P>0.05)。pEGFP-PTEN组〔(65.84±7.59)%〕明显低于对照组(P<0.05)。

2.3细胞凋亡检测结果 对照组和pEGFP组细胞凋亡率〔(7.69±0.98)%，(7.84±1.32)%〕差异无统计学意义(P>0.05)，pEGFP-PTEN组〔(26.93±2.45)%〕明显高于对照组(P<0.05)。

2.4ROS检测结果 对照组和pEGFP组ROS水平(1.00±0.13，1.03±0.08)差异无统计学意义(P>0.05)，pEGFP-PTEN组(2.95±0.24)明显高于对照组(P<0.05)。

2.5β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3表达检测结果 对照组和pEGFP组β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3水平差异均无统计学意义(P>0.05)，pEGFP-PTEN组β-catenin、c-myc水平均明显低于对照组，而酶切Caspase-3水平高于对照组(P<0.05)。见图2，表2。

图2 Western印迹检测β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表达

表2 3组β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3水平比较

3 讨 论

PTEN基因定位于10q23.3，其编码的蛋白质由403个氨基酸组成，在人体内的多种组织和器官中均广泛表达，是一种抑癌基因〔6,7〕。PTEN具有维持免疫系统稳定、胚胎发育、抑制血管新生等作用，对于细胞的增殖能力也具有抑制作用〔8〕。有研究表明，PTEN mRNA和蛋白在子宫内膜癌、肺癌、肝癌、肾透明细胞癌、皮肤鳞状细胞癌等癌组织中表达下调，过表达PTEN后癌细胞的生长受到抑制〔9～12〕。Nuciforo等〔13〕研究表明，PTEN能够调控乳腺癌细胞的凋亡。邹志建〔14〕检测了103例慢性淋巴细胞白血病患者中PTEN的表达发现，PTEN在T淋巴细胞白血病患者中表达下调。以上研究结果均表明，PTEN参与癌症的发生过程。本研究结果提示，PTEN能够调控急性T淋巴细胞白血病细胞的增殖和凋亡，发挥抑癌基因的作用。

细胞凋亡的发生与细胞内多种基因的调控有关，是一个极为复杂而严格的过程。Caspase蛋白家族是细胞凋亡的重要调控因子，当凋亡信号发出时，细胞Caspase级联反应被激活，最终使Caspase-3活化生成酶切Caspase-3从而发挥凋亡执行的作用，而Caspase-3的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志〔15〕。ROS参与细胞内多种信号通路的传导，与细胞的生长和凋亡有关，当细胞内ROS水平异常升高时，细胞凋亡增加〔16〕。董瑞红等〔17〕研究表明，吴茱萸碱能够通过促进白血病细胞中ROS水平升高和上调酶切Caspase-3的水平诱导白血病细胞的凋亡。Xu等〔18〕研究表明，Disulfiram作用后的白血病细胞中ROS水平升高2.8倍，细胞凋亡率高达27%。这些研究结果均表明，细胞中ROS、Caspase-3参与白血病细胞的生长和凋亡。提示，PTEN可能通过作用于ROS水平和酶切Caspase-3的表达影响急性T淋巴细胞白血病细胞的生长和凋亡。

Wnt信号通路参与细胞的生长和凋亡，其激活后β-catenin表达上调，下游靶基因c-myc水平升高〔19〕。Wnt信号通路与白血病的发生有关，通过RNA干扰技术抑制Wnt信号通路激活后，白血病细胞的凋亡增加〔20,21〕。本研究结果提示，PTEN可能通过抑制Wnt信号通路的激活促进急性T淋巴细胞白血病细胞的增殖，促进人急性T淋巴细胞血病细胞凋亡。综上，PTEN能够促进急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡，抑制急性T淋巴细胞白血病细胞增殖，ROS和Wnt信号通路可能是其作用机制之一。

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