外周血M2/M1单核细胞比例在乳腺癌诊断中的临床价值

杜 艳，刘 华，张波克，刘鷖雯，何怡青，杨翠霞，张国良，高 锋

（1.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海 200233 2.上海交通大学附属第六人民医院中心实验室，上海 200233）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一[1]，目前临床诊断乳腺癌的方法主要依赖于体格检查和影像学检查，但这些方法对于早期乳腺癌的发现敏感性很低。而目前常用来诊断乳腺癌的血清标志物——癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）对乳腺癌早期诊断的敏感性和特异性均不理想，因此寻找新的肿瘤标志物迫在眉睫[2]。

单核细胞由骨髓释放入血，在血中3～4 d后进入组织和浆膜腔转变成巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用。有研究表明，TAM在肿瘤组织中通常具有2种功能截然不同的极化状态，即M1和M2。M1型巨噬细胞一般出现在肿瘤发生的早期、良性病变以及癌巢周围组织中，具有杀伤肿瘤细胞、促进炎症反应等功能；M2型巨噬细胞存在于整个肿瘤的发生、发展过程中，具有促进肿瘤生长、血管形成、肿瘤转移等功能[3]。TAM的极化是一个动态发展的过程，根据肿瘤的进展，TAM可受肿瘤微环境异常改变的透明质酸作用而发生M2极化[4]。既往有研究证实，TAM能够伴随着癌细胞穿过肿瘤组织内的毛细血管壁进入外周血循环[5-6]。因此，外周血循环中M2/M1单核细胞比例的动态变化可能对乳腺癌的诊断具有重要意义。

近年有研究显示，结直肠癌以及霍奇金淋巴瘤等患者的外周血M2单核细胞水平升高[7-8]，结直肠癌患者外周血和组织中M1单核及巨噬细胞并没有明显改变[7]。目前已知乳腺癌组织中M2型巨噬细胞增多，且与肿瘤进展呈正相关[4]。但关于乳腺癌患者外周血M2/M1单核细胞比例变化的研究尚未见报道。因此，本研究试图通过采用流式细胞术分析乳腺癌患者外周血M2/M1单核细胞比例变化，并与乳腺癌常规的肿瘤标志物（CEA、CA15-3）进行对比，分析外周血M2/ M1单核细胞比例对乳腺癌的临床诊断价值。

1 材料和方法

1.1 外周血标本的收集

收集2017年1—6月上海交通大学附属第六人民医院住院的乳腺癌患者术前的乙二胺四乙酸抗凝外周血标本89例，患者年龄（51.05±10.12）岁，既往无肿瘤感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病，且术前均未接受放疗、化疗及药物治疗。选取体检健康者53名，年龄（50.50±7.78）岁。血液标本的收集符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》（2013版）的原则，全部研究对象知情同意。

1.2 主要试剂

异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的CD14抗体、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的CD86抗体购自美国Beckman Coulter公司；别藻蓝蛋白（allophycocyanion，APC）标记的CD163抗体购自美国Biolegend公司；PE标记的CD204抗体购自美国R&D公司。

1.3 流式细胞术检测外周血中M1、M2单核细胞

采用全血标本100 μL，一管同时加入CD14、CD163、CD204抗体检测M2单核细胞（CD14+CD163+CD204+），另一管同时加入CD14、CD163、CD86抗体检测M1单核细胞（CD14+CD163-CD86+），振荡混匀，室温避光反应25 min；加入2 mL 荧光激活细胞分离仪溶血剂，振荡混匀，室温避光放置10 min；加入300 μL 1%（质量分数）多聚甲醛；于2～8 ℃暗处保存，24 h内上机分析。

1.4 血浆CEA、CA15-3的检测

使用乙二胺四乙酸抗凝血液收集血浆。将收集管里的血液标本1 900 × g 4 ℃离心10 min。将血浆转移至Eppendorf管中，12 000×g 4 ℃离心10 min，去除细胞来源碎片。将上清移至新的Eppendorf管中，冻存于-80 ℃。检测前，将其在室温下溶解，将溶解好的血浆样本在16 000×g 4 ℃离心5 min，吸取上清，根据试剂盒使用说明书在Cobas 6000化学发光分析仪（瑞士Roche公司）上进行CEA、CA15-3检测。

1.5 统计学方法

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布的数据以表示，2组样本之间的比较采用两独立样本Student's t检验。非正态分布数据以中位数（四分位数） [M（P25～P75）]表示，2组样本的统计学比较采用Mann-Whitney U检验。M2/M1单核细胞比例诊断乳腺癌敏感性和特异性的评价用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测乳腺癌患者及体检健康者外周血中M2、M1单核细胞的表达

本研究试图从外周血中检测M2和M1单核细胞。首先以前角散射光和侧角散射光的中间细胞群设门，再以CD14+细胞群设门，M2单核细胞分析CD163+CD204+双阳性细胞，M1单核细胞分析CD163-CD86+细胞，见图1（a）。结果显示乳腺癌患者外周血CD14+CD163+CD204+的M2单核细胞（5.88±1.31）较体检健康者（3.70±1.00）增加（p＜0.05），见图1（b）。乳腺癌患者外周血CD14+CD163-CD86+的M1单核细胞（27.89±5.69）较体检健康者（33.83±5.80）减少（p＜0.05），见图1（c）。

图1 乳腺癌患者及体检健康者外周血M2、M1单核细胞的表达

2.2 乳腺癌患者与体检健康者外周血M2/M1单核细胞比例、CEA及CA15-3差异的分析

基于M2单核细胞与M1单核细胞之间存在动态转换，本研究进一步分析了外周血M2/M1单核细胞比例变化。发现乳腺癌患者与体检健康者外周血M2/M1单核细胞比例差异有统计学意义（p＜0.001）。同步分析了血浆CEA、CA15-3的水平差异，发现CA15-3在乳腺癌患者与体检健康者之间差异有统计学意义（p＜0.05），而CEA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表1。

图2 各组M2/M1单核细胞比例与血清CEA、CA15-3水平的比较

表1 乳腺癌患者与体检健康者M2/M1单核细胞比例等指标的比较

2.3 M2/M1单核细胞比例的ROC曲线分析

经ROC曲线分析发现，外周血M2/M1单核细胞比例所对应的ROC曲线的曲线下面积大于CEA和CA15-3。见图3。

图3 M2/M1单核细胞比例、CEA和CA15-3诊断乳腺癌的ROC曲线

3 讨论

恶性肿瘤的进展是一个极其复杂的多步骤、多因素过程，越来越多的数据证明，在实体瘤的微环境中浸润了大量TAM。TAM具有明显的表型可变性和功能多样性。在乳腺肿瘤微环境中，TAM极化成经典激活的M1型巨噬细胞和选择性激活的M2型巨噬细胞[9]。有研究提示随着肿瘤进展，TAM以M2型为主，主要发挥抑制炎症，促进组织修复及促进肿瘤细胞生长、侵袭、转移等作用[3]。既往认为血液中的单核细胞进入组织转变为巨噬细胞后，一般不再返回血液循环，但近年来发现肿瘤组织中的TAM能够进入外周血，引起外周血该类细胞的增加，鉴于TAM的不同极化类型与肿瘤的密切关系，分析外周血单核细胞极化差异很可能成为一种新的肿瘤诊断指标。前期研究发现在非小细胞肺癌和结直肠癌患者外周血中以M2单核细胞为主，M2单核细胞能够作为一种诊断实体瘤的生物标志物[10，7]。最新研究提示乳腺癌外周血同样以M2单核细胞为主[11]，但现有的关于TAM表型的临床数据非常有限，鲜有报道分析外周血M1单核细胞的表达情况以及M2与M1单核细胞比例的动态转化。根据TAM 2种极化状态可因环境的改变而相互转换的特性，本研究综合分析M2/ M1单核细胞比例变化在乳腺癌患者与体检健康者之间的差异。本研究发现乳腺癌患者外周血M2/M1单核细胞比例（0.166±0.110）明显高于体检健康者（0.090±0.032）（p＜0.001）。

目前，已知CEA和CA15-3是诊断乳腺癌的常用肿瘤标志物，但由于敏感性和特异性较低，CEA与CA15-3并不适合应用于乳腺癌的早期诊断[12-13]。本研究结果表明，乳腺癌患者血浆CA15-3水平高于体检健康者，而CEA水平在乳腺癌患者和体检健康者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究将M2/M1单核细胞比例数据与CEA、CA15-3表达水平进行比较分析，发现M2/M1单核细胞比例对于乳腺癌的诊断价值优于CEA及CA15-3。因此，就诊断乳腺癌而言，外周血M2/M1单核细胞比例的诊断潜能要优于CEA和CA15-3。

本研究结果表明，外周血M2/M1单核细胞比例可能作为一种非创伤性的新的诊断乳腺癌的肿瘤标志物。然而本研究仍然存在一些不足之处：首先，外周血M2、M1单核细胞所选择的表型标志物有限，本研究仅选择CD163+CD204+来反映M2单核细胞的表达情况，选择CD163-CD86+来反应M1单核细胞的表达情况；其次，本研究选取的样本量较少，需进一步扩大样本量来验证本研究的结果。

从外周血中发现敏感、特异的肿瘤标志物用于肿瘤的早期诊断是近年肿瘤诊断学的一个热点。本研究用流式细胞术比较了外周血M2/M1单核细胞比例在乳腺癌患者和体检健康者间的表达差异，并用ROC曲线评价其诊断性能，同时与临床较常用的肿瘤标志物进行了比较分析。结果提示M2/M1单核细胞比例是一种十分有效的乳腺癌循环肿瘤标志物，但其临床应用价值还需结合临床病理资料进行更深入的评价。

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