抗核抗体与EB病毒抗体水平的关系

张敏杰， 高玉芳

（咸阳市中心医院，陕西 咸阳 712000）

EB病毒 （Epstein-Barr virus，EBV）是一种普遍存在的γ-疱疹病毒，世界范围内有＞90%的人被其感染，其通过在B细胞内表达限定数量的病毒抗原而实现潜伏性感染。EBV急性感染可导致50%的年轻人出现传染性单核细胞增多症（infectious mononucleosis，IM），并出现大量的病毒复制。据推测，IM患者发展成为多发性硬化（multiple sclerosis，MS）和其他自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）的风险增加了20倍[1]。因为EBV感染引起的IM发生区域与MS的患病区域有相似之处，所以IM患者更易患MS。对MS患者体内的EBV特异性抗体进行检测，发现MS患者血清中EBV核抗原（EBV nuclear antigen，EBNA-1）IgG水平明显升高[2]。国外有文献报道，在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者体内EBNA-1 IgA和EBV-衣壳抗原（virus capsid antigen，VCA）IgA滴度升高，EBV-早期抗原（early antigen，EA）/D IgA的阳性率为58%，然而健康对照者血清EBVEA/D IgA检测呈阴性[3]。虽然EBV与淋巴瘤形成之间的关系日益明确[4]，但其在自身免疫性反应中的作用尚不明了。这些EBV相关的AID可能是由具有不同遗传背景的人体内EBV的免疫调节能力发生改变引起的。本研究通过对比分析抗核抗体（anti-nuclear antibody，ANA）、抗可提取性核抗原（extractable nuclear antigen，ENA）抗体与EBV抗体水平的关系，探讨EBV感染状态对自身抗原免疫反应调节的作用。

1 材料和方法

1.1 样本来源

80例样本均来自2015年12月—2017年2月咸阳市中心医院门诊就诊或住院采用间接免疫荧光法检测ANA为阳性的患者，其中男8例、女72例，年龄（50.4±17.7）岁。80例样本中抗ENA抗体阳性样本74例。分离血清，置-70 ℃保存待测。以体检中心的48名体检健康者为健康对照组，其中男5名、女43名，年龄（48.9±18.5）岁，无自身免疫性疾病及家族史，ANA和抗ENA抗体均为阴性。

1.2 ANA的检测

采用间接免疫荧光法检测ANA，试剂盒来源于德国欧蒙公司。每个反应区同时有Hep-2细胞系和猴肝组织2种抗原基质，Hep-2细胞及猴肝组织均无特异性荧光为阴性，Hep-2细胞及猴肝组织产生明显特异性荧光为阳性。根据荧光模式对ANA进行分型，荧光较暗、核型不易区分者为弱阳性。

1.3 抗ENA抗体谱的检测

采用免疫印迹法体外定性检测血清或血浆中的人抗nRNP/Sm、Sm、SS-A/Ro、SS-A/Ro-52、SS-B/La、Scl-70、Jo-1、CENP B、ds-DNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白12种不同抗原IgG类抗体，试剂盒由德国欧蒙公司提供，结果在欧蒙公司提供的软件上进行分析。临界值计为阴性。操作按试剂盒说明书进行。

1.4 抗EBV抗体的检测

采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测EBVVCA IgM、EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG，试剂盒由德国欧蒙公司提供。按试剂盒说明书进行操作。用ELx800酶标仪（美国Bio-Tek公司）在450 nm波长处进行比色，测定每个孔的吸光度（A）值。通过计算患者样本或对照血清A值与标准品A值的比值定性判断EBV-VCA IgM结果，比值≥1.1为阳性。EBV-VCA IgG、EBVEA IgG和EBNA-1 IgG以3份标准血清的浓度和A值分别为横、纵坐标点对点作标准曲线，根据此标准曲线求出血清中抗体的浓度。对A值超出标准品1（200 RU/mL）的样本进行1∶400稀释后重新测定，根据标准曲线计算出的数据乘以4即为样本中抗体的浓度。以EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG≥22 RU/mL为阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。抗EBV抗体阳性率的比较采用Pearson χ2检验。定量资料呈偏态分布，用中位数（四分位数）[M（P25，P75）]描述，2组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ANA阳性患者与健康对照者血清抗EBV抗体水平的比较

ANA阳性组血清EBV-VCA IgM阳性4例（5.00%），EBV-VCA IgG阳性80例（100.00%），EBV-EA IgG阳性25例（31.25%），EBNA-1 IgG阳性80例（100.00%）。健康对照组血清未见EBVVCA IgM阳性反应，EBV-VCA IgG阳性47例（97.92%）；EBV-EA IgG阳性6例（12.50%），EBNA-1 IgG阳性45例（93.75%）。ANA阳性组EBV-EA IgG阳性率明显高于健康对照组（χ2=5.747，P=0.017）。ANA阳性组血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平较健康对照组明显升高（Z值分别为-5.59、-2.64、-4.52，p＜0.01）。见表1。

表1 ANA阳性组和健康对照组血清抗EBV抗体水平的比较 [RU/mL，M（P25，P75）]

2.2 抗ENA抗体阳性组与阴性组抗EBV抗体水平的比较

在抗ENA抗体谱中，抗SS-A/Ro抗体、抗SS-B/La抗体阳性组分别与抗SS-A/Ro抗体、抗SS-B/La抗体阴性组比较EBNA-1 IgG水平明显升高（Z=-2.630，P=0.008；Z=-2.515，P=0.011），EBV-VCA IgG 和EBV-EA IgG水平差异无统计学意义（P＞0.05）。抗核小体抗体阳性组与抗核小体抗体阴性组比较EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明显升高（Z=-2.355，P=0.018；Z=-2.017，P=0.043），但2组之间EBNA-1 IgG水平差异无统计学意义（P＞0.05）。抗CENP B抗体阳性组与抗CENP B抗体阴性组比较EBNA-1 IgG水平明显降低（Z=-2.25，P=0.024）。见表2。

表2 抗ENA抗体阳性组与阴性组抗EBV抗体水平的比较 [RU/mL ，M（P25，P75）]

2.3 ANA阳性患者抗ENA抗体阳性个数与抗EBV抗体水平的关系

抗ENA抗体谱中自身抗体阳性个数不同的ANA阳性患者EBV-EA IgG水平不同（χ2=11.380，P=0.023），从抗ENA抗体阴性到自身抗体阳性个数≥4，ANA阳性患者血清EBV-EA IgG水平升高。但自身抗体阳性个数为2个和自身抗体阳性个数为3个的患者，EBVEA IgG水平分布差异无统计学意义（Z=-1.65，P=0.100）。抗ENA抗体谱中自身抗体阳性个数不同的患者EBV-VCA IgG和EBNA-1 IgG水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 抗ENA抗体阳性个数与抗EBV抗体水平 [RU/mL，M（P25，P75）]

3 讨论

现有的研究结果表明，EBV具备在活动性的裂解复制感染周期与潜伏状态之间相互转变的能力[5]。在原发感染期，宿主细胞内的EBV是以裂解复制感染周期的方式存在，EBV裂解周期抗原EBV-EA/D既可位于受感染细胞的细胞质内，也可存在于细胞核内，其与病毒DNA聚合酶所处的位置相同，对病毒基因的复制非常重要。原发性EBV感染急性期EBV-VCA IgG通常到达峰值较迟，并且衰退较慢，急性期以后EBV-VCA IgG能够以相对稳定的滴度持续存在。原发感染后，EBV通常进入潜伏期，为了逃避宿主细胞的免疫杀伤，仅表达少量的基因产物。这一时期EBNA-1充当着复制因子的角色。因此，EBNA-1 IgG的存在排除了急性感染情况，提示感染处于既往感染期。一旦EBV由潜伏感染进入到裂解复制感染周期时，EBV-EA/D是其表达的第1个抗原，并且EBV-EA/D是免疫系统发挥作用的明确目标。

本研究通过比较ANA阳性患者与ANA阴性健康对照者血清抗EBV抗体水平，发现EBV-VCA IgM的阳性率在ANA阳性患者与健康对照者间并没有明显差异，但ANA阳性患者血清EBV-EA IgG阳性率明显高于健康对照者（p＜0.017）。同时，ANA阳性患者血清EBVVCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG水平比健康对照者明显升高（p＜0.01）。本研究结果与文献结果[6]相符。EBV-EA/D在EBV裂解复制感染周期中对病毒基因复制起到重要的作用，推测可能是EBV复发感染或慢性反复持续感染导致患者ANA出现阳性反应之故。但EBV复发感染或慢性持续感染为何会导致ANA出现阳性反应，HARLEY等[7]研究发现，狼疮抗体的产生源于抗EBNA-1抗体的体液免疫应答，EBNA-1抗原表位传播导致抗SSA/Ro抗体和抗SmB抗体产生。另有研究结果表明，SLE患者外周血单个核细胞中出现EBNA-1和潜伏膜蛋白1的表达增加[8]。如果原发性EBV感染急性期或复发感染是SLE发病的重要机制，那么Harley等的研究结果则与这一假设不谋而合。有研究结果表明，抗ds-DNA抗体是SLE患者的特异性标志抗体，是诊断及判断SLE患者疾病活动性的重要指标之一[9]。某些临床诊断为混合性结缔组织病和系统硬化症的患者也检出抗ds-DNA抗体阳性，可能与患者全身结缔组织受累有关。佟大伟等[10]用间接免疫荧光法、ELISA及放射免疫法检测抗ds-DNA抗体，120例SLE患者3种方法检出抗ds-DNA抗体阳性率分别为25%、32%和32%。杨林等[11]用ELISA、免疫印迹法及间接免疫荧光法检测98例AID（类风湿性关节炎、未分化结缔组织病、多发性肌炎/皮肌炎、系统性硬化症、原发性干燥综合征等）患者抗ds-DNA抗体的阳性率分别为11.9%、7.1%和5.1%。本研究80例ANA阳性患者并未确诊是否为SLE患者或其他AID患者，抗ds-DNA抗体阳性率为11.25%（9/80）。抗ds-DNA抗体阳性组与抗ds-DNA抗体阴性组比较EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG和EBNA-1 IgG均无差异。但9例抗ds-DNA抗体阳性组EBNA-1 IgG水平[183.30（134.06，312.63）RU/mL]高于71例抗ds-DNA抗体阴性组[160.40（94.30，481.33）RU/mL]。由于抗ds-DNA抗体与SLE密切相关，因此EBV潜伏感染产物EBNA-1 IgG水平升高可能诱发SLE。然而，这需要加大抗ds-DNA抗体阳性样本量以进一步评价。

EBV具有嗜B淋巴细胞的特性，大多数EBV感染者处于潜伏状态，EBNA-1为其潜伏感染状态下的病毒表达产物。在外界某些因素的刺激下，病毒的潜伏感染状态被破坏，病毒进入裂解复制感染周期，这一过程中病毒基因表达大量病毒产物，促进病毒在宿主细胞中散播，造成宿主免疫系统紊乱。据报道SSA/Ro和EBNA-1蛋白具有高度同源性[12]。本研究对比分析了抗ENA抗体谱中各种自身抗体与抗EBV抗体水平的关系，发现抗SS-A/Ro抗体阳性组与抗SS-A/Ro抗体阴性组比较，抗SS-B/La抗体阳性组与抗SS-B/La抗体阴性组比较，EBNA-1 IgG水平均明显升高（p＜0.05），EBV-VCA IgG和EBV-EA IgG水平未见差异，本研究结果与文献结果[13]相符。同时，抗CENP B抗体阳性组与抗CENP B抗体阴性组比较，EBNA-1 IgG水平明显降低（P=0.024），结果发现13例抗CENP B抗体阳性患者其抗SS-A/Ro抗体基本为阴性。这一结果印证了EBNA-1与自身抗原SS-A/Ro具有同源性，EBNA-1诱导机体产生的特异性EBNA-1 IgG抗体反应与SS-A/Ro发生交叉反应，从而在AID的发生、发展中起重要作用。此外，本研究发现抗核小体抗体阳性组与抗核小体抗体阴性组比较，EBV-VCA IgG、EBV-EA IgG水平明显升高（p＜0.05）。随着抗ENA谱中自身抗体个数的增多，EBV-EA IgG水平明显升高（P=0.023）。总之，本研究结果更进一步说明了自身抗体与EBV免疫反应之间的紧密关系。然而，需要更大量的同质性种群研究来深入阐述病毒在自身免疫机制中的作用。

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