氯化两面针碱肠吸收研究

2018-06-02森姜黎慕杨娜

中国中医药现代远程教育 2018年10期

赵森姜黎慕杨娜邹明*

（1大连大学附属中山医院药剂科，辽宁大连 116001；2辽宁中医药大学附属第二医院伦理教研室，辽宁沈阳 110032）

两面针药味辛、苦、微温，小毒，具有祛风通络、胜湿止痛、消肿解毒等作用。主要成分为生物碱，氯化两面针碱为两面针的主要成分，测定不同含量的两面针提取物在大鼠小肠的吸收情况，采用紫外分光光度法测定肠循环液中酚红的含量，标定体积，采用高效液相色谱法测定氯化两面针碱的含量。目前对两面针的药动学研究较少，本实验在体法预测氯化两面针碱的吸收情况。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 LC6A高效液相色谱仪（日本岛津）；Agilent色谱工作站（美国）；HH-S11-Z型电恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）；电子天平（Sartorius，德国）；SHB-3循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；T101-100型蠕动泵 (保定兰格恒流泵有限公司)；氯化两面针碱对照品 (上海纯优科技有限公司，批号：6872-57-7)；酚红 (上海试剂三厂)；乌拉坦溶液（自制）；Kerbs-Ringer营养液（以下简称K-R营养液，自制）[1]。

1.2 实验动物雌雄Wistar大鼠40只，雌雄各半（大连医科大学实验动物中心）；合格证号SCXK（辽）2008-0002]。

1.3 样品溶液的测定方法

1.3.1 在体吸收的实验原理被动扩散是消化吸收的最重要途径，用Fink方程式可以描述这一过程，方程变换后inX=inX0-式中的X0为初始药物量；X为吸收后药物量；t为吸收时间；以时间t对inX作图应为一条直线，斜率Kα为药物在小肠吸收的速率。

1.3.2 循环液中酚红的测定方法

1.3.2.1 空白循环液（以下简称K-R营养液）称取氯化钠7.8 g，氯化钾0.35 g，氯化钙0.37 g，氯化镁0.02 g，碳酸氢钠1.37 g，磷酸二氢钠0.32 g，葡萄糖1.4 g，加纯化水溶解定容至1000 mL容量瓶中，即得。

1.3.2.2 酚红测定波长的选择酚红KR营养液、对照品储备液、对照品酚红KR营养液，于700～200 nm范围扫描，结果在558 nm处KR营养液、氯化两面针碱对酚红无干扰。

1.3.2.3 酚红测定方法按照大鼠小肠吸收实验方法，在肠循环液中加入定量的酚红。

精密配制浓度为10 μg/mL、25 μg/mL、 50 μg/mL酚红K-R营养液，置洁净试管中，加入0.2 mol/L的NaOH溶液5 mL，摇匀，按紫外-可见分光光度法在558 nm波长处测定吸光度。

1.3.2.4 酚红标准曲线制备精密量取酚红储备液适量，稀释成浓度为 5.0 μg/mL、 10.0 μg/mL、 25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、 100.0 μg/mL酚红溶液，按酚红测定方法操作，测定吸光度。得标准曲线方程：A=0.0172C+0.0212， r=0.9999。（n=6）酚红在5 μg～100 μg/mL范围内，线性关系良好。

1.3.2.5 精密度考察取低、中、高三种浓度的酚红储备液，按酚红测定方法操作，测定吸光度，RSD=0.3%，结果表明，精密度良好。

1.3.2.6 稳定性考察分别于0、2、4、6、8 h取样，按酚红测定方法操作，测定吸光度，RSD=0.3%，结果表明，稳定性良好。

1.3.2.7 重复性考察取同一样品5份，按酚红测定方法操作，测定吸光度，RSD=0.4%，结果表明，重复性良好。

1.3.2.8 加样回收率考察取酚红适量（含酚红1 mg、2.5 mg、5 mg），分别置具塞锥形瓶中，分别加入浓度为10 μg/mL、 25 μg/mL、 50 μg/mL的酚红溶液50 mL。平均RSD为1.1%，结果表明，方法回收率良好。

1.3.3 循环液中氯化两面针碱HPLC测定方法

1.3.3.1 色谱条件 Diamonsil XDB-C18（150×4.6 mm，5.0 μm）；磷酸盐缓冲液-乙腈 (55∶45)， pH=3.5；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：328 nm；柱温：室温；进样量： 10 μL。

1.3.3.2 干扰项考察以上述色谱条件，取K-R营养液、氯化两面针碱K-R营养液、酚红溶液各10 μL进样。

氯化两面针碱的保留时间为12.466 min，K-R营养液、酚红溶液的保留时间均在5 min以内，通过实验表明K-R营养液及酚红中组分对氯化两面针碱无干扰。

1.3.3.3 标准曲线精密吸取浓度为9.792 μg/mL的氯化两面针碱对照品溶液，分别进样5.0 μL、8.0 μL、10.0 μL、 15.0 μL、 20.0 μL，回归方程为y=8.5089x+90.361， r=0.9994，表明进样量在0.049～0.1958 μg线性关系良好。

1.3.3.4 精密度试验连续进样5次，每次10 μL，测定其峰面积，RSD=1.4%，结果表明，试验方法精密度良好。

1.3.3.5 稳定性试验分别在0、2、4、6、8、10 h，进样，测定氯化两面针碱的色谱峰面积，RSD=0.4%，结果表明，试验方法稳定性良好。

1.3.3.6 重复性试验取样品5份，按照拟定的色谱条件，分别精密量取上述供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，RSD小于3，结果表明，实验方法重复性符合有关规定。

1.3.3.7 加样回收率试验按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，取已知氯化两面针碱含量（20.22 mg/g）的样品适量，精密称定，共5份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为0.2448 mg/mL的氯化两面针碱对照品溶液4 mL，精密吸10 μL，注入液相色谱仪，计算回收率，氯化两面针碱低、中、高浓度平均回收率为（100.81%±1.1）%、（99.87%±1.2）%、（101.3%±1.1）%。本方法回收率良好。

1.4 动物实验设计取Wistar大鼠15只，随机分成高、中、低3个剂量组，将实验前禁食（自由饮水）12 h的大鼠称重后，以0.6 mL/100g的20%的乌拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后的大鼠固定在手术台板上，保持体温37℃，沿腹中线切开约3 cm，以直径为0.5 cm的玻璃管做胃肠道插管，与循环泵的胶管连接组成回路，先用37℃的盐水5 mL/min冲洗肠道，约10 min，直至肠道冲洗干净，然后用K-R营养液平衡5 min，将样品溶液200 mL连入循环装置中，以2.0 mL/min循环3 h，自实验开始后0 min、 15 min、 30 min、 60 min、 90 min、120 min、150 min、180 min分别取回流液1 mL，并补充等量的酚红储备液，以酚红标定体积，测定浓度分别为3.31 μg/mL、 6.62 μg/mL、 33.11 μg/mL氯化两面针碱的吸收率。