煎煮时间对附子毒性的影响研究*

2018-06-02刘福存单乐天肖鲁伟黄家卫

中国中医急症 2018年5期

孙婉刘福存袁强单乐天肖鲁伟黄家卫

（浙江中医药大学，浙江杭州 310000）

附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）子根的加工品，味辛、甘，性大热，有毒，归心、肾、脾经；具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阴寒水肿、寒湿痹痛等症［1］，是四川道地药材之一，早在《神农本草经》中就有附子的记载，称其为“百药之长”［2］。现代药理研究表明：附子具有强心、升压、抗休克、抗血栓形成、抗腹泻和糖皮质激素样作用［3］等多种药理作用。《中国药典》中生附子剂量是 3～15 g［4］，《中药大辞典》中用于内服的汤煎剂剂量为 3～9 g，回阳救逆可用 18～30 g［5］。近年来，中医火神派代表人物吴佩衡、范中林用方时常有剂量动辄60 g，更有甚者达到250～500 g左右，比起中国药典规定的3～15 g用量相差甚远。临床报道表明，附子中毒的毒性主要表现在心血管系统、神经系统、消化系统等。如口唇、舌及肢体麻木，胸闷，呼吸困难，头晕，心慌，咽喉、食管、胃部烧灼感，恶心呕吐，严重者可出现休克、心律失常、昏迷，甚至死亡［6］。其中附子用量过大也是附子不良反应较多的重要原因之一。附子的主要活性成分是乌头类生物碱，它们既是附子的药效成分，也是主要的毒性成分［7-8］。乌头类生物碱尤其是双酯二萜类生物碱，如乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等的毒性大。据文献报道乌头碱能够让人中毒的内服剂量为0.2 mg，口服双酯类生物碱 2～3 mg 即可致人死亡［9］。附子是一味常用中药，然而其毒性影响了开发和使用。本实验以不同煎煮时间的附子为样本，采用高效液相法测定其3种毒性成分含量；对ICR小鼠进行急性毒性观察和评价，探索不同煎煮时间对附子毒性的影响，为其临床安全用药提供文献依据。

1 材料与试剂

1.1 实验仪器岛津LC-20A高效液相色谱仪，KQ5200B超声机（昆山市超声仪器有限公司），80-2电动离心机（常州奥华仪器公司），HH系列数显恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司），RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）

1.2 实验动物 ICR小鼠，雌雄各半，18～20 g，由浙江中医药大学动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.3 药物与试剂附子（购于四川江油中坝附子科技发展有限公司，产地：四川江油，批号 160701）经浙江中医药大学葛尔宁教授鉴定为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）子根的加工品。乌头碱（批号：16031105）、新乌头碱（批号：16032504）、次乌头碱（批号：16032106），均购自成都曼思特。甲醇（色谱级，美国 TEDIA，批号：13060412），三乙胺（分析级，上海化学试剂，批号：20091201），氯仿（分析级，西陇化工股份有限公司，批号：121128），二氯甲烷（分析级，天津赛浮瑞科技有限公司，批号：20120406001），娃哈哈纯净水（色谱级，杭州娃哈哈百立食品有限公司，批号：3106BL）

1.4 附子原药材鉴定液的制备取附子粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液 50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，水温＜25℃）30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入二氯甲烷4 mL溶解，滤过，取续滤液，即得。

1.5 附子不同时间水煎液的制备取2份生附子50 g分别置于1 L的圆底烧瓶中，加10倍的水，浸泡30 min，各加回流提取30、60 min滤过，残渣加入8倍的水，再各加热回流提取30、60 min；滤过，合并两次煎液，真空减压加热浓缩1 g/mL，即得不同时间煎煮液，各煎煮液以5000 r/min离心10 min，取上清液即得。

2 HPLC测定不同煎煮时间的附子水煎液中3种毒性生物碱的含量

2.1 色谱条件 Hypersil-BDS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100∶50∶3∶0.15）为流动相，流速：1 mL/min，柱温 30 ℃，进量样 5 μL。

2.2 对照品溶液的制备精密称取新乌头碱、乌头碱、次乌头碱标准品各1.0、0.96、1.4 mg，加入10 mL二氯甲烷定容，充分摇匀溶解作为对照品混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备供试品1溶液制备：取制备的附子原药材鉴定液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品1溶液。供试品2、3溶液制备：取不同煎煮时间（30、60 min）的附子水煎液各 18 mL，分别用二氯甲烷和氯仿，各萃取3次，18 mL/次，合并二氯甲烷和氯仿层萃取液，55℃减压回收至干，加二氯甲烷定容3 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品2、3溶液。

2.4 样品含量测定按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，根据标准曲线，计算样品中3个毒性成分的含量。

3 HPLC试验结果

3.1 系统适用性试验按照上述色谱条件，取2.3项下所制备的供试品1、2、3溶液分别进样，所得谱图见图1。

供试品1溶液（附子水煎0 min）

供试品2溶液（附子水煎30 min）

图1 不同煎煮时间附子水煎液HPLC色谱图

3.2 线性关系考察分别将“2.2”项下所配制的的新乌头碱（0.1 mg/mL）、乌头碱（0.096 mg/mL）和次乌头碱（0.14 mg/mL）的混合对照品溶液稀释 2、4、6、8、10 倍。在上述色谱条件下，按稀释液浓度由低至高顺序依次进样。以平均峰面积对进样量进行线性回归。回归方程见表1，表明在上述范围内线性关系良好。

表1 3种乌头碱的线性关系

3.3 精密度试验取“2.2”项下制备的系列混合对照品溶液 5 μL，按“2.1”项下色谱条件，重复测定 6次，测定峰面积，结果表明，新乌头头碱、乌头碱和次乌头碱峰面积的RSD分别为1.2%、1.8%、2.3%。

3.4 稳定性试验取供试品溶液5μL，分别于 0、1、2、4、8、12 h进样，测定峰面积，新乌头碱、乌头碱和次乌头碱峰面积的RSD分别为1.1%、2.0%、1.8%。表明供试品溶液在12 h稳定性良好。

3.5 重复性试验按“2.3”项下平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样5 μL，测定峰面积，新乌头碱、乌头碱和次乌头碱的峰面积RSD分别为1.49%、2.43%、1.08%。

3.6 加样回收率试验精密称取0.1g已知3种毒性成分含量的附子粗粉6份，分别精密加入与样品中等量的对照品，按“2.3”项下方法制备得供试品溶液，用“2.1”项下色谱条件各进样5 μL，测定3种乌头碱的峰面积，新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的平均加样回收率（n=6）为 99.2%、96.8%、99.5%，RSD 分别为 1.84%、2.4%、1.33%。

3.7 样品中3种毒性成分检测由表2可知，附子0 min水煎液中3种乌头碱含量最高。随着煎煮时间的延长，新乌头碱在附子水煎30 min和附子水煎60 min含量变化不大，乌头碱和次乌头碱含量明显减少，煎煮60 min时，乌头碱几乎检测不到（由于样品中3个成分含量差异较大，附子水煎0 min是经过稀释后测量的；而附子水煎30 min和附子水煎60 min的样品是经过萃取后测量的，最后统一折换成生药量）。

表2 样品中3种乌头碱的含量（n＝3，μg/g）

4 小鼠急性毒性试验

4.1 药物制备 1）附子0min药物制备。按“1.4”项下方法制备附子的异丙醇-乙酸乙酯混合溶液，将续滤液40℃减压回收溶剂至干，残渣加入蒸馏水溶解，使得药物浓度达到5 g/mL，即得。2）附子水煎液的制备。按“1.5”项下方法制备附子水煎30 min药液和附子水煎60 min药液，并将水煎液浓缩到5 g/mL。

4.2 分组及给药取清洁级ICR小鼠32只，按体质量随机分组：正常对照组、附子0 min组，附子水煎30 min组、附子水煎60 min组，每组8只，雌雄各半。实验前小鼠禁食不禁水12 h。各组小鼠按100 kg/g灌胃给药，每日1次，连续7 d，正常对照组每日给予蒸馏水。

4.3 小鼠日常及行为学观察各组小鼠灌胃给药后，正常饲养，每日观察，4 h后称取体质量，密切观察各小鼠的动度进食、饮水情况及7 d内可能出现的饮食异常、异常肌肉运动、对外反应迟缓、瞳孔改变、异常分泌物、大小便异常、眼球凸出、眼睑下垂、呼吸异常、皮肤颜色改变等毒性反应和死亡情况。若有小鼠死亡，则将死亡小鼠解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等脏器的病理变化，7 d观察期结束后，将每组存活的小鼠取血处死并进行解剖，按照上述同样方法对主要脏器大体病理变化进行肉眼观察并记录。小鼠取血后，将所取的血样水平静置2 h，3000 r/min低速离心10 min，取上清液即得小鼠血清。采用相关仪器设备检测血清中以下指标：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（GOT）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）。

4.4 统计学处理应用SPSS23.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

5 小鼠急性毒性试验结果

5.1 小鼠急性毒性症状观察灌胃后，附子0 min组和附子水煎30 min组急性毒性表现相似，表现为呼吸急促，躁动不安，之后闭眼，眼球浑浊、黯淡，精神沉郁，呼吸短促，体温偏低，懒动，协调性差等现象。特别是附子0 min组症状加重，尾巴青紫，被毛凌乱。附子水煎60 min组小鼠无显著变化，活动量减少；正常对照组小鼠活跃，在笼中来回走动，摄食饮水均正常。死亡的小鼠被毛凌乱、无光泽，尾巴、四肢青紫，眼球塌陷。对死亡小鼠进行解剖，肝脏体积增大、色暗红、边缘变钝，其他脏器无明显异常。

5.2 附子水煎液给药后对存活小鼠的体质量变化见表3。与正常对照组相比，各给药组小鼠的体质量明显下降（P＜0.05）；通过比较体质量差值可知不同煎煮时间的附子水煎液对小鼠的毒性有显著差异（P＜0.05）；说明随着煎煮时间的延迟，附子对小鼠的毒性降低。

表3 不同时间附子水煎液对小鼠体质量的影响（g，±s）

—表示无数据，给药1 d后即死亡。与正常对照组比较，*P＜0.05。下同。

组别 n 体质量差值给药前体质量给药后体质量正常对照组 8 2.37附子0 min组 8 —附子水煎30 min组 8 -1.45*24.63±1.84 27.00±2.04 23.31±2.03 —24.85±2.65 23.40±2.29*附子水煎60 min组 8 -0.25*23.63±2.62 23.38±3.10*

5.3 各组小鼠死亡率统计见表4。附子0 min组灌胃给药30 min后，小鼠均发生死亡现象，死亡率为100.00%；附子水煎30 min组第3日给药发现小鼠死亡，给药7 d后，小鼠死亡率为37.50%；而附子水煎60 min组和空白组小鼠在给药7 d内无死亡现象。

表4 不同煎煮时间的附子对小鼠死亡率的影响

5.4 各组小鼠血常规检查结果见表5。与正常对照组相比，附子水煎30 min组小鼠血液中ALT、GOT、CK和LDH含量均升高且差异有统计学意义（P＜0.05）表明附子水煎30 min水煎液对肝脏和心脏有一定的毒性。但附子水煎 60 min水煎液中 ALT，AST，CK和LDH含量与正常对照组相比，均未见显著差异（P＞0.05）。

表5 各组小鼠血常规检查结果比较（±s）

组别 n ALT（U/L） GOT（U/L） CK（U/L） LDH（IU/L）正常对照组 3附子水煎30 min组 3 30.27±0.61 79.60±4.40 859.67±123.46 762.72±120.38 71.13±2.60*159.50±88.96*1843.38±1364.77*1668.52±335.78*附子水煎60 min组 344.67±9.60 82.77±11.97 491.41±339.49 848.10±501.04

3 讨论

明代张景岳把附子称作“良将”，《伤寒论》中涉及到附子的条文共有37条，包含附子的方药共就有20首，并被历代医家广泛应用，可见附子在治病救人方面表现出的重要性，其中在万方数据库中检索到，在500张习用方子中，排名第9位［10］，附子的使用率为13.20%，可见其地位超然。但因附子毒性强烈，如有使用不当又可置人于死地，所以说附子当之无愧为“最有效亦最难用的药”［11］。由于附子有毒性，临床不乏不良反应的病例报道。如何避免附子的毒性反应，是附子临床应用中需要足够重视的问题。炮制既可以使中药的疗效得以提高，使药物的不良反应消除或降低，又可以改变药物的性味、功能和临床疗效［12］。生附子毒性剧烈，一般需经过炮制后使用。附子的炮制方法有着悠久的历史，每个朝代的炮制方法各不相同，其中汉代以炮、煨、炒、烧等炮制方法为主，而到了唐代以后，在原有基础上增加了一些炮制方法，例如有蜜制、黑豆制、醋制、姜制、童便制、甘草制及多种辅料浸制、煮制、蒸制［13］。附子的煎煮时间也影响其毒性与药效。附子的毒性作用主要是其中所含的生物碱——乌头碱类所致，其主要毒性是抑制心脏传导系统。但乌头碱水溶性大，遇热易被分解破坏，生附子经盐水浸泡、蒸熟，加工成熟附子后，不稳定不耐热的乌头碱已大部分被分解破坏，不及生附子含量的20%［14］。通过煎煮以降低附子的毒性，目前常用的方法是久煎。根据HPLC结果可知，煎煮时间的延长，使得3种毒性成分含量下降；小鼠急性毒性实验表明附子水煎时间越长，小鼠的死亡率降低，其体质量下降得越发不明显。但水煎60 min的附子水煎液中双酯型生物碱（新乌头碱和次乌头碱）仍旧存在；且在急性毒性实验中小鼠体质量减轻，表明附子水煎60 min后毒性仍存在，对人的健康造成威胁。在煎煮过程中双酯型生物碱先水解转化为单酯型生物碱和水解型单酯型生物碱，然后进一步水解成毒性可基本忽略的生物原碱（胺醇型生物碱）［15］。可见煎煮时间对酯型生物碱的含量有显著影响，适度久煎可显著降低双酯型生物碱含量，增加单酯型生物碱含量，即解毒存效，但过度久煎可完全破坏双酯型生物碱，也使单酯型生物碱含量下降，即药理活性亦随之减弱或消失［16］。本实验专注点在于煎煮时间对附子毒性的影响，只一味得延长煎煮时间，苯甲酰类生物碱含量也会下降，其药效也会大打折扣。应当在后续实验中加入单酯这个考察因素，通过HPLC检测其含量或者通过相关的细胞实验来检测药效。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：191-193.

［2］神农本草经［M］.北京：人民卫生出版社，1982.

［3］王胜林，董耀荣.附子水煎液对心梗后心力衰竭大鼠血流动力学的影响［J］.陕西中医，2007，28（6）：745-748.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015.

［5］南京中医药大学.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，2013.

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［11］杨明，徐楚江，邹文铨.附子炮制新方法［P］.中国，CN91110997.8.1992（6）：17.

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