益气活血解毒方对肺癌A549/DDP耐药细胞株JAK2-STAT3信号通路的干预作用研究*

2018-06-02史东萍

中国中医急症 2018年5期

史东萍李强

（河南中医药大学第一附属医院，河南郑州 450000）

肺癌是目前全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，2012年全球肺癌新发病180万例，死亡160万例，分别占184个国家28种癌症发病和死亡的13%和19.4%［1］。目前，化疗在肺癌的治疗中仍然发挥着重要的作用，然而耐药问题的存在严重影响了化疗的效果［2］。现代医学针对化疗耐药缺乏有效的手段，中医从整体出发，通过辨证论治认识和改善化疗耐药，取得了较好的疗效［3］。结合肺癌和化疗耐药的病机特点，临床运用益气活血解毒法能够有效抑制肺癌化疗耐药，增强化疗药物的疗效。本研究观察益气活血解毒方对A549/DDP耐药细胞株的抑制作用及细胞凋亡的影响，并通过JAK2-STAT3信号通路分子的变化探讨益气活血解毒方的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞株 SD大鼠，清洁级，体质量（200±20） g，雌雄不限。动物许可证号：SCXK（豫）2010-0002。A549细胞、A549/DDP细胞株保存于河南中医药大学第一附属医院实验室。

1.2 药物与试剂益气活血解毒方由党参、黄芪、丹参、川芎、水蛭、蜈蚣、全蝎、连翘、白花蛇舌草组成。药物由河南中医药大学第一附属医院提供。MTT购自Sigma公司；JAK2、STAT3单克隆抗体购自CST公司；β-actin一抗、牛抗鼠二抗、羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司；细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司；RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；反转录试剂盒购自Vazyme公司；SYBR®Green I荧光定量PCR试剂盒购自Qiagen公司。

1.3 益气活血解毒方含药血清制备大鼠随机分为益气活血解毒方高剂量组、益气活血解毒方中剂量组、益气活血解毒方低剂量组和空白对照组，每组10只。按“动物与人体的每千克体质量剂量折算系数表”计算大鼠等效用药剂量，分别给予益气活血解毒方高、中、低剂量及等量0.9%氯化钠注射液灌胃，每日2次，连续3 d，末次给药1 h后采血，分离血清，并将含药血清置于56℃水浴锅中30 min灭活补体，0.22 μm抽滤除菌，-80℃冰箱保存备用。

1.4 益气活血解毒方含药血清对A549/DDP细胞抑制作用比较 A549/DDP细胞培养于37℃，5%CO2培养箱中，细胞至对数生长期时，消化收集细胞并种板，待细胞生长至80%融合后，无血清培养基同步化12 h，分别加入益气活血解毒方高、中、低剂量血清和空白对照血清，不加细胞的培养基为空白组，继续培养12、24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 20 μL，4 h 后，DMSO 溶解，用酶标仪检测490 nm处各孔的吸光度（A）值。细胞生长抑制率（%）＝（实验组平均A值-空白组平均A值）/（对照组平均A值-空白组平均A值）×100%。

1.5 各组细胞凋亡率比较采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测各组细胞的凋亡情况。分别培养A549和A549/DDP细胞，根据细胞抑制实验结果进行分组：A549空白对照血清组（A549组）、A549/DDP空白对照血清组（A549/DDP组）、A549/DDP益气活血解毒方最佳含药血清组（益气活血解毒方组），药物干预48 h后，分别收集各组细胞（1×105），冷PBS洗涤2次，悬浮于200 μL上样缓冲液中，分别加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，再于流式管中再加入无菌的PBS缓冲液300 μL，流式细胞仪上机检测。实验测得的结果用Flow Jo7.6软件进行分析。实验重复3次。

1.6 各组细胞总蛋白中JAK2、STAT3的表达比较分别培养A549和A549/DDP细胞，分组同“1.5”项下方法。药物干预48 h后，PBS洗2次，用RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，一抗（JAK2、STAT3，内参蛋白为βactin），4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL孵育3～5 min，用数字化 Western Blot 扫膜仪（C-Digit，美国LI-COR）扫描采集膜上的蛋白条带，利用Image J软件分析计算各条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.7 各组细胞JAK2、STAT3 mRNA表达比较各组细胞JAK2、STAT3 mRNA的表达分别培养A549和A549/DDP细胞，分组同“1.5”项下方法。收集各组细胞，试剂盒提取细胞总RNA，核酸蛋白测定仪测定样品RNA浓度和纯度，参照试剂盒说明书配置反转录体系，42℃30 min、85℃5 min进行反转录反应。以反转录获得的cDNA为模板，参照SYBR®Green Master Mix试剂盒说明书配制荧光定量PCR反应体系，35～40个循环。GAPDH作为内参基因，利用2-△△Ct法分析各组目的基因的表达变化。GAPDH引物序列：上游5′-AAGACCTTGGGCTGGGACTG-3′，下游 5′-TGGCTCG GCTGGCGAC-3′，产物 168 bp。 JAK2 引物序列：上游5′-GGATGTGAGTGGGAGCTGAG-3′，下游 5′-CCTGC TTCTGAAACCCGGC-3′，产物 121 bp。 STAT3 引物序列：上游 5′-CATCCTGAAGCTGACCCAGG-3′，下游5′-AGGTCGTTGGTGTCACACAG-3′，产物 73 bp。

1.8 统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组含药血清在不同时间点对A549/DDP细胞的抑制率比较见表1。随着时间的延长，益气活血解毒方含药血清对A549/DDP细胞的抑制率整体上在48 h时达到高峰，与12、24 h抑制率差异有统计学意义（P＜0.05），至72 h各剂量组抑制率已呈现下降趋势。不同浓度含药血清之间比较，高剂量组＞中剂量组＞低剂量组，考虑到有文献报道［4-5］抑制率超过10%时不仅抑制肿瘤细胞生长，同时也会影响正常细胞的代谢，因此最终选择中剂量含药血清作用48 h为最佳浓度和时间点，用于后续实验。

表1 各组含药血清在不同时间对A549/DDP的抑制率比较（%，±s）

与本组 12 h 比较，△P＜0.05；与本组 24 h 比较，▲P＜0.05。

组别 n 12 h 24 h 48 h 72 h益气活血解毒方高剂量组益气活血解毒方中剂量组6.16±0.38 8.04±0.26 12.45±0.81△▲ 7.78±0.51 5.85±0.46 6.49±0.42 8.92±0.77△▲ 6.18±0.76益气活血解毒方低剂量组4.70±0.16 5.28±0.33 6.51±0.25▲ 6.07±0.52

2.2 各组A549/DDP细胞凋亡情况比较见表2。与A549组比较，A549/DDP组细胞凋亡率明显下降；与A549/DDP组比较，益气活血解毒方组A549/DDP细胞凋亡率显著提高（P＜0.05）。

表2 各组细胞凋亡情况比较（%，±s）

与 A549 组比较，△P＜0.05；与 A549/DDP 比较，▲P＜0.05。下同。

组别 n 早期凋亡细胞晚期凋亡细胞细胞凋亡率A549组 6 A549/DDP组 6 6.33±1.35 5.87±1.12 12.15±2.39 2.50±0.81 3.58±1.24 6.14±2.72△益气活血解毒方组 65.65±1.46 9.02±2.55 14.70±3.76▲

2.3 各组细胞JAK2、STAT3蛋白表达比较见表3、图1。与A549细胞组比较，A549/DDP细胞组JAK2、STAT3蛋白表达明显降低（P＜0.05），与A549/DDP组比较，益气活血解毒方组A549/DDP细胞JAK2、STAT3蛋白表达明显升高（P＜0.05）。

表3 各组细胞JAK2、STAT3蛋白表达比较（%，±s）

组别 n JAK2相对表达量 STAT3相对表达量A549组 6 A549/DDP组 6 0.62±0.25 0.94±0.29 0.44±0.13△ 0.51±0.12△益气活血解毒方组 60.78±0.15▲ 1.18±0.32▲

图1 各组细胞JAK2、STAT3蛋白免疫印迹条带图

2.4 各组细胞JAK2、STAT3 mRNA表达比较见表4。与 A549细胞组比较，A549/DDP细胞组 JAK2、STAT3 mRNA 表达明显降低（P＜0.05），与 A549/DDP组比较，益气活血解毒方组A549/DDP细胞JAK2、STAT3 mRNA 表达明显升高（P＜0.05）。

表4 各组细胞JAK2、STAT3 mRNA表达比较（±s）

组别 n GAPDH（Ct值）JAK2 STAT3 Ct值 △Ct值 2-△△Ct Ct值 △Ct值 2-△△Ct A549组 17.61±0.7623.84±0.85 6.22±1.42 22.22±0.59 4.61±1.29 A549/DDP组 18.70±0.83 27.16±0.78 8.47±1.24 0.21△ 25.29±0.71 6.60±1.14 0.25△益气活血解毒方组 17.18±0.64 23.96±0.62 6.80±0.78 3.21▲ 21.40±0.54 4.23±1.03 5.18▲

3 讨论

化疗耐药是限制目前肿瘤治疗众多化疗方案疗效的基本问题，化疗耐药的机制主要包括促进肿瘤细胞的药物外排、增强化疗导致的损伤修复、调节细胞凋亡信号通路抑制肿瘤细胞凋亡等［6］。增殖和凋亡调节失控是化疗耐药发生的重要机制，促凋亡基因的缺失或抗凋亡基因的过度表达多会导致肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性［7］。JAK2/STAT3通路是人体内生理与病理反应的一条重要信号途径，是多种恶性肿瘤发生的关键因素，参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化、发育及转移过程［8-9］。大量研究证实，JAK2/STAT3 在肺癌、卵巢癌、肾癌、慢性粒细胞白血病、骨髓瘤等疾病中持续异常高表达，能够激活转录Bcl-2、Bcl-x1等凋亡基因，从而调控细胞的凋亡［10-11］。

中药因其低毒高效和多阶段性作用的优势已在肿瘤多药耐药逆转的研究中逐步受到重视［12-13］。中药对于NSCLC化疗耐药干预主要是通过减少化疗药物的外排，抑制细胞核屏蔽功能、减少药物的代谢，调整凋亡失衡等方面［14］实现的。刘亚莉等研究发现，补中益气汤含药血清能使通过降低Bad、NF-κB表达、提高Caspase-9表达，进而促进 A549/DDP细胞的凋亡［15］。徐立群等发现，参慈胶囊能升高A549/DDP荷瘤裸鼠肺癌组织DKK-3 mRNA表达，降低β-catenin、Cyclin-D1 mRNA表达，通过影响wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达，可能是参慈胶囊逆转人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内顺铂耐药的作用机制之一［16］。

益气活血解毒方由党参、黄芪、丹参、川芎、水蛭、蜈蚣、全蝎、连翘、白花蛇舌草组成，具有益气活血、解毒通络的功效。本研究显示，不同剂量益气活血解毒方含药血清作用后，A549/DDP的增殖均受到不同程度的抑制，在干预48 h时抑制率达到最大；通过对细胞凋亡的观察发现，A549/DDP细胞凋亡率相对于A549下降，而益气活血解毒方能明显促进A549/DDP的凋亡，这说明益气活血解毒方可能通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡干预肺癌化疗耐药。进一步探讨其作用机制发现，与A549细胞组比较，A549/DDP细胞组JAK2、STAT3蛋白及mRNA表达明显降低，与对照血清组比较，益气活血解毒方最佳含药血清组A549/DDP细胞JAK2、STAT3蛋白及mRNA表达明显升高。这提示益气活血解毒方干预肺癌化疗耐药的作用可能与调节JAK2-STAT3信号通路，促进细胞凋亡实现的。

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