复合涂膜处理对中国对虾保鲜的影响

柏 韵,李 然,+,郭雪松,*,张 振,2,*,张冬阳,张立斌,李 亮

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001;2.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

中国对虾,又称东方对虾,与墨西哥棕虾、圭亚那白虾齐名,并称世界三大名虾,是我国分布最广的对虾类[1]。中国对虾的蛋白质含量丰富而脂肪含量较低[2],是典型的高蛋白、低脂肪型食物,对人体健康具有重要意义。然而,由于虾肉中蛋白质和水分的含量较高,肌肉组织较松软,死后僵硬期短,自溶作用迅速,导致其新鲜度下降快,易腐败变质,严重影响其营养价值和食用性[3]。因此,虾的保鲜问题已经成为人们研究的热点。

壳聚糖又称可溶性甲壳质,具有良好的成膜性能、抑菌性能、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注[4-5],其作为保鲜剂正日益成为果蔬贮藏保鲜研究的热点。ε-聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂[6],因其安全性高于其他化学防腐剂且抑菌谱广，被用于食品防腐[7]。卡拉胶作为增稠剂同样被广泛的应用于食品中[8-9]。本实验将三种物质进行复合,通过预实验得到最优配比,同时以无处理组和单独涂膜组为对照,对中国对虾进行涂膜处理,以感官评定、菌落总数、pH、TVB-N、TBA、质构特性、SDS-PAGE凝胶电泳为指标,探究不同涂膜处理对中国对虾新鲜度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中国对虾 平均体重(15±2) g的中国对虾,购自中国锦州市大润发超市;壳聚糖 脱乙酰度为大于85%,食品级;卡拉胶 河南洪鑫食化有限公司;ε-聚赖氨酸 山东欣鼎生物科技有限公司;营养琼脂培养基 生工生物工程(上海)股份有限公司;硫代巴比妥酸、Tris、SDS、丙烯酰胺 北京索莱宝科技有限公司;1,1,3,3-四乙氧基丙烷 酷尔化学科技(北京)有限公司;三氯乙酸、磷酸三丁酯、盐酸、冰醋酸、EDTA、氧化镁,硼酸 天津市风船化学试剂科技有限公司;甘氨酸、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)、巯基乙醇、过硫酸铵、溴酚蓝、甲醇 天津市大茂化学试剂厂;考马斯亮蓝R-250 天津市博迪化工有限公司。

WDP-9062电热恒温培养箱 上海安亭科学仪器有限公司;PHS-3C型精密pH计 上海雷磁仪器有限公司;分析天平 上海精密科学仪器有限公司;电子万用炉 天津市泰斯特仪器有限公司;追直流超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司;电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;UV-6300型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;KQ3200B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;TMS-PRO型质构仪 北京盈盛恒泰科技有限公司;美国BIO-RAD PowerPac Basic电泳仪。

1.2 实验方法

1.2.1 涂膜液的制备 将1.5 g壳聚糖溶解在含1%冰醋酸的蒸馏水中,制备1.5%的壳聚糖涂膜液,记为壳聚糖组;称取0.15 g ε-聚赖氨酸蒸馏水定容至100 mL,记为ε-聚赖氨酸组;称取1.5 g壳聚糖、0.13 g ε-聚赖氨酸、0.19 g卡拉胶,用含1%冰醋酸的蒸馏水定容至100 mL,记为复合组。将购买的中国对虾随机分为四组,无任何处理的记为空白对照组,其余三组分别在不同的保鲜剂中浸泡5 min,取出于室温沥干,分装到聚乙烯无菌保鲜袋中后,贮藏于4 ℃冰箱中。

1.2.2 感官评定 根据赵海鹏感官评定标准进行改动[10]。评定小组由7人组成(六女一男),虾的评定项目由体表色泽、气味、肌肉形态组成,总分值在12分(非常新鲜)和3分(完全腐败)之间,6分以下为不可接受,具体评分标准见表1。

表1 感官评定评分表Table 1 Sensory evaluation scores table

1.2.3 菌落总数 参照国标GB 4789.2-2010,食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数的测定[11]。

1.2.4 pH的测定 称取1 g剁碎的虾肉,加入9 mL煮沸后冷却的蒸馏水,均匀搅拌,静置30 min,用pH计测定上清液pH。

1.2.5 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定 参照GB 5009.228-2016食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定[12],按半微量定氮法测定TVB-N。

1.2.6 硫代巴比妥酸值的测定 准确称取5 g样品,置于100 mL有盖三角瓶内,加入25 mL三氯乙酸混合液,振摇0.5 h,用双层滤纸过滤,除去油脂。滤液重复用双层滤纸过滤一次。准确移取上述滤液5 mL置于25 mL比色管内,加入5 mL TBA溶液,混匀,加塞,置于90 ℃水浴内保温40 min,取出,冷却1 h,移入小试管内,离心5 min,上清液倾入25 mL纳氏比色管中,加入5 mL氯仿,摇匀,静置,分层,吸出上清液于532 nm波长比色,对照标准曲线得到微克数(同时做空白实验)。

1.2.7 质构特性的测定 选取对虾第二节约1 cm3大小,测定探头为直径50 mm的P50平底柱形探头,测试参数设定为:初始力度:0.8 N、探头回升高度:25 mm、测试速度:60 mm/min、行变量30%[13]。

1.2.8 SDS-PAGE凝胶电泳

1.2.8.1 肌原纤维蛋白的提取 随着贮藏时间的增加,蛋白质中降解最快的即为肌原纤维蛋白,本实验将贮藏第10 d的中国对虾进行肌原纤维蛋白提取,通过比较不同降解程度探究涂膜处理对保鲜的影响。参考Xiong等[14]的方法并加以修改。将虾肉搅碎,加入4倍体积磷酸盐缓冲液(pH=7.5),均质,在4 ℃冷冻离心机中8000 r/min离心15 min,除去上清液,用4倍体积磷酸盐缓冲液(pH=7.5)清洗沉淀,离心,重复三次。最后一次用四层纱布过滤,所得滤液离心,沉淀即为肌原纤维蛋白。

1.2.8.2 分离胶和浓缩胶的配制 按表2中溶液的顺序及比例,制备10%的分离胶 4.8%的浓缩胶。

表2 分离胶和浓缩胶配比Table 2 Ratio of separation gel and concentrate

1.2.9 统计分析 数据表示为平均值,做三次平行,伴随着平均值的标准误差。SPSS软件进行分析,显著性p<0.05

2 结果与分析

2.1 感官评定

王二霞等[15]的研究表明,感官评价快速、简便,是消费者判断食品新鲜度的主要方式。如图2所示,中国对虾贮藏期间感官品质总体呈下降的趋势,其中空白组下降的最明显,在第7 d感官评分为5.9,低于可接受值。壳聚糖涂膜组在第9 d接近腐败值,这可能是因为壳聚糖涂膜处理在虾的表面形成一层保护膜,有效地降低微生物的繁殖和对虾体内蛋白质的变化,使得对虾的肌肉形态有了更好的品质,同样涂膜处理减少了某些挥发性物质的产生,使得对虾的气味与空白组相比有了较好的评价。ε-聚赖氨酸处理组同样在第9 d接近最低可接受值,ε-聚赖氨酸可以抑制微生物的增长,减少挥发性物质的产生。复合涂膜处理与前三组相比有更好的感官评分,在第11 d才达到不可接受值,与空白组相比延长了4 d。

图1 中国对虾贮藏期间感官评价变化Fig.1 Changes in sensory scores of Chinese shrimp during refrigerated storage

图2 中国对虾贮藏期间细菌总数变化Fig.2 Changes in total viable counts(TVC)of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.2 菌落总数

根据M osfer M的研究表明[16],菌落总数不大于5.0 lg cfu/g为一级鲜度,5.0～5.7 lg cfu/g为二级鲜度,达到106～107cfu/g通常表明已极其腐败,不能食用,此时判定为货架期终点。在本实验中,新鲜中国对虾的菌落总数为2.2 lg cfu/g左右,属于一级鲜度。随着时间的增加,菌落总数逐渐增加,其中无处理的空白组细菌繁殖的最快,在第3 d达到4.64 lg cfu/g,第5 d接近二级鲜度上限,达到5.52 lg cfu/g,认定为腐败变质。其次,壳聚糖单独涂膜组细菌总数在第7 d为5.58 lg cfu/g接近二级鲜度限值,说明壳聚糖涂膜具有一定的抑菌性,可以减缓细菌繁殖的速率,有效的起到保鲜的作用。经过ε-聚赖氨酸涂膜处理的对虾细菌总数在第9 d接近二级鲜度上限,其抑菌效果更加明显。与前三组的处理相比,复合涂膜处理组的细菌生长速率更加缓慢,在第7 d才达到二级鲜度值,第9 d接近限值,且复合涂膜组细菌总数均低于单独涂膜组,货架期较空白组相比延长了4 d,这主要是因为在复合涂膜液中的壳聚糖和ε-聚赖氨酸存在协同增效作用,使抑菌效果更好。

2.3 pH

动物肌肉pH的变化与其新鲜度密切相关,测定对虾肌肉的pH可以作为判断其新鲜度的参考标准之一[17]。由图可知,四组初始pH约为7.01,相互之间的pH差别不大,说明涂膜处理并不影响对虾的初始pH。随着时间的增加,到第5 d为止,三种处理方法的pH均呈现下降的趋势,这是由于虾死后肌肉中的糖原被降解,生成乳酸等酸类物质[18],造成肌肉pH的下降。从第5 d开始,pH开始增加,这是因为在自身酶和微生物的作用下,虾肉中的蛋白质、氨基酸及其他含氮物质被分解为氨、三甲胺、吲哚、组胺等碱性物质[19],使得肌肉pH上升。从整体上看,涂膜处理的三组pH上升的较为缓慢,根据Sham shad[20]的研究表明,pH在7.6以上则认为是不可接受的值,从图中可知,空白组的pH在第9 d达到7.53,壳聚糖和ε-聚赖氨酸涂膜处理组在第11 d时pH达到7.61和7.62,复合涂膜组在第13 d达到7.64。涂膜组的pH在贮藏后期明显低于空白组，说明单独涂膜和复合涂膜处理均可有效地保持中国对虾的品质,延长货架期。

图3 中国对虾贮藏期间pH变化Fig.3 Changes in pH of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.4 TVB-N值

挥发性盐基氮也称挥发性碱基总氮,是水产品新鲜度评价中的经典评定方法,最能反映水产品的新鲜度变化[21]。根据 GB 2733-2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》[22],海水鱼、虾中挥发性盐基氮的可接受值低于30 mg/100 g。不同处理组对中国对虾贮藏期内TVB-N值如图5所示。无处理的空白组TVB-N值开始出现明显的上升趋势,在第9 d达到30.2 mg/100 g,超出标准。壳聚糖和ε-聚赖氨酸涂膜组同样出现上升趋势,但上升的幅度明显小于无处理组,TVB-N值分别在第11 d达到29.68和31.92 mg/100 g,区别不大。复合涂膜组的TVB-N值在第13 d超出标准,同样比空白组延长4 d,这与其他指标的检测结果相同。说明壳聚糖和ε-聚赖氨酸具有抑菌作用,可以有效的降低细菌对蛋白质的分解,达到延缓TVB-N含量上升的作用。

图5 中国对虾贮藏期间TVB-N变化Fig.5 Changes in TVB-N values of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.5 TBA值

TBA值是用于评估脂质氧化程度所广泛使用的指标[23],与肉类脂肪氧化程度有很强的相关性,TBA值越大,说明脂肪的氧化程度越高,酸败就越严重。脂肪酸发生氧化的降解产物丙二醛(MDA)能够与TBA反应生成稳定的红色复合物[24]。贮藏期间不同处理方式的TBA值如图4所示,中国对虾的TBA值在起始时都很低,均在0.05左右。随着贮藏时间的增加,四组TBA值均出现上升的趋势,但涂膜处理组的值均明显低于无处理的空白组(p<0.05),其中复合涂膜的效果更加明显,说明涂膜保鲜可以在一定程度上延缓对虾脂肪氧化的程度。

图4 中国对虾贮藏期间TBA变化Fig.4 Changes in TBA values of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.6 质构

2.6.1 硬度 在中国对虾的贮藏过程中质构特性会发生改变,其中硬度作为一种测量指标可以较好地反映对虾肌肉组织的变化趋势[25]。如图6所示,随着贮藏时间的增加,四个处理组中的虾肉硬度都呈现先小幅增加,之后逐渐降低的过程,这是由于虾死后会经过经历僵直、自溶和腐败3个阶段,在僵直期内虾肉硬度会有所提高,僵直期解除后硬度开始下降[26]。其中无处理的空白组硬度下降的最快,壳聚糖处理次之,复合涂膜处理下降缓慢。说明进行涂膜处理可以减缓中国对虾体内酶和微生物的作用,使虾的自溶期延后,维持较好的硬度。

图6 中国对虾贮藏期间硬度变化Fig.6 Changes in hardness of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.6.2 咀嚼性 咀嚼性是指将半固体的样品阻嚼成吞咽时的稳定状态所需的能量[27],如图7所示,随着贮藏时间的增加,咀嚼性总体呈现下降的趋势,其中空白组下降的最为迅速。虾死后肌肉中胶原分子结构发生改变,蛋白质开始降解,肌原纤维之间结构疏松,导致肌肉软化,进而导致咀嚼性降低,涂膜处理可以延缓蛋白质变性,从而使咀嚼性下降缓慢,其中复合涂膜组效果最好。

图7 中国对虾贮藏期间咀嚼性变化Fig.7 Changes in chewiness of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.6.3 弹性 如图8所示,在中国对虾贮藏期间,弹性整体呈下降趋势。其中无处理的空白组下降最明显,复合涂膜处理最能有效减少弹性的变化。这是由于涂膜处理在中国对虾外壳形成新的保护膜,可以有效地阻碍微生物的生长及虾肉组织中蛋白质的变化。同时,复合膜中的卡拉胶具有一定的凝胶强度,可以有效地改良膜的性能,使经过复合涂膜液处理的中国对虾具有更好的弹性。

图8 中国对虾贮藏期间弹性变化Fig.8 Changes in elasticity of Chinese shrimp during refrigerated storage

2.7 SDS-PAGE凝胶电泳分析

肌原纤维蛋白是组成肌肉中肌原纤维的蛋白质,其中肌球蛋白占蛋白质总量的54%,肌动蛋白占蛋白质总量的20%～25%,还有原肌球蛋白、肌原蛋白和少量功能不明的调节性结构蛋白质。随着贮藏时间的增加,大分子量蛋白会逐渐水解为小分子量,SDS-PAGE凝胶电泳择能够显示肌原纤维蛋白水解情况。如图9所示,不同处理组间蛋白质均出现了一定程度的降解,在分子量为97.4 kDa时,只有复合组出现条带,说明复合涂膜处理后的中国对虾中依然存在较大分子量的蛋白。在43 kDa分子量的肌动蛋白条带中,第四泳道的复合组颜色最深,其次是壳聚糖组,说明经过此两种处理方法后的中国对虾中肌动蛋白含量较多,水解程度低。在31 kDa分子量处,前三种处理方式之间区别不大,但都条带清晰,复合组颜色最深,说明贮藏10 d后经过四种处理方法的中国对虾中均含有一定量的原肌球蛋白,复合组含量最多。而在14.4 kDa处,空白组条带最明显,说明空白组中更多的蛋白质被水解成小分子量蛋白。总体来看,复合涂膜组效果最明显,能够有效地抑制蛋白质降解情况。

图9 中国对虾纤维蛋白SDS-PAGE电泳图谱Fig.9 SDS-PAGE electrophoresis patterns of fibrin from Chinese shrimp注:M:Maker;1:空白处理;2:壳聚糖涂膜处理;3:ε-聚赖氨酸处理;4:复合涂膜处理。

3 结论

实验结果表明,经过单独涂膜和复合涂膜处理的中国对虾在冷藏过程中,其菌落总数、pH、TBA值、TVB-N含量和质构特性等指标均明显低于空白对照组,感官评分也具有较好的效果。涂膜处理可以有效的抑制细菌生长,减缓蛋白质分解和脂肪氧化的速度,其中,复合涂膜处理组比单独涂膜处理效果更好,与空白组相比可将中国对虾的货架期延长4 d。因此复合涂膜处理在中国对虾的保鲜中具有良好的应用前景。

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