HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法 分析干姜中的姜辣素类化合物

梁 娜,桑亚新,周 妍,刘卫华,李田叶,王向红

(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071000)

姜,盛产于亚洲,特别是中国南部和印度地区[1]。干姜为姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根茎,其加工过程包括净制、切制和炮制,以四川犍为产品最佳[2]。药理研究表明干姜具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗溃疡、镇痛、利胆等作用[3-4]。干姜主要的功能因子为姜辣素,它是有刺鼻气味的一种弱极性的酚类混合物,包括姜酚、姜烯酚、姜酮等,是黄色油状液体,味辣而苦,是姜特征性风味的主要呈味物质[5-7]。研究表明,无论是体外还是在体内实验姜辣素都体现了抗癌、抗氧化等药理活性[8],具有良好的应用前景和社会效益[9-11]。

当前,很多学者在研究姜辣素或姜中有效成分的检测方法[12-16],现报道的姜辣素检测方式一般为高效液相色谱法(HPLC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)。王维皓等人[15]利用HPLC方法仅测定了生姜中6-姜辣素含量,由于姜辣素是一类酚类混合物,所以对其他姜辣素类化合物物质的分析还有待研究。张永鑫等人[14]建立了姜及其炮制品中姜辣素类化合物含量的测定方法(HPLC),但此方法未能成功检测到含量相对较低的姜酮,在以后的研究中还需提高其检测灵敏度。虽然GC-MS技术已广泛应用于姜的分析且可分析出低含量的物质[17-18],但由于姜辣素的低挥发性,样品处理方面较为复杂且可能会出现分析不全

面的问题。然而,液质联用技术(LC-MS)可以很好地解决上述所有问题。李峰武[19]用HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS的方法灵敏、简便快速的分析延胡索水提物中的化学成分,骆宜等人[20]同样利用液质联用技术高效、准确的鉴定了决明子中的化学成分。由此可见,液质联用(LC-MS/MS)分析技术是一种简便、快速的分析方法,在食品分析、环境分析和医药研究等许多领域已得到了广泛应用[21-23]。本实验不仅仅局限于姜辣素化合物单一成分的测定,还将对姜辣素类化合物的组成进行分析,并采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术对姜辣素类化合物进行分离。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干姜,生姜 保定安国中药材批发市场;乙腈 色谱纯,天津科密欧试剂有限公司;6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚 色谱纯,上海源叶生物科技有限公司。

液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱仪 日本岛津公司;Agilent 1200型高效液相色谱仪 美国安捷伦有限公司;RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;QTSX6150超声波清洗器 天津市瑞普电子仪器公司;TGL16M离心机 长沙易达仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姜辣素的制备 将购买的同一批次的干姜粉碎后过60目筛,筛分于干燥器中保存备用。精密称取制备好的粉末约1.0 g,加入40 mL甲醇,超声处理30 min,重复超声一次,取上清液4500 r/min离心10 min,将离心后的上清液,移入梨形瓶中,将残渣重复离心操作一次,合并离心液旋转蒸发至干,加入1 mL甲醇复溶,过有机微孔滤膜(0.45 μm)[15],待用。

1.2.2 LC-MS法分离鉴定姜辣素类化合物

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱:Syncronis C18(5 μm×250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈(A相)和0.1%甲酸水(B相),流动相梯度见表1;流速:0.3 mL/min;柱温40 ℃;进样量:2 μL;采样时间:15 min。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.2.2.2 质谱条件 采用全离子扫描模式方式,电喷雾离子源(ESI),离子源温度:200 ℃;雾化气体流速:1.5 L/min;脱溶温度:200 ℃;扫描范围:100～1000 m/z;扫描时间:15 min。

1.2.2.3 样品测定 按“1.2.2.1”条件下对样品进行姜辣素类物质的定性分析,并利用相同的提取检测方法对同一产地的生姜姜辣素也进行了对比分析。

1.3 数据分析

运用Office软件进行分析。

2 结果与讨论

2.1 样品测定

本文用液相色谱确定了干姜姜辣素中5种物质的基本含量,同时与生姜的姜辣素进行了对比分析,结果见表2。可看出干姜的姜辣素含量明显的高于生姜,证明干姜的加工方式会增加其有效成分的含量,提高其利用价值。

表2 干姜姜辣素液相测定结果(n=6)Table 2 The content of gingerols in dried ginger(n=6)

2.2 干姜中姜辣素类化合物LC-MS分析

与水组合时乙腈的分离效果和洗脱效果都较好;选用流动相为乙腈和0.1%甲酸水进行梯度洗脱得到了如图1、图2所示的液相结果图。由图可知,在此液相条件下,各化合物分离度高、峰型较好、信号较强,可以实现干姜总提取物的良好分离。

图1 姜辣素标准品液相图Fig.1 Liquid phase diagram of gingerol standard

图2 干姜样品液相图Fig.2 Liquid phase diagram of dried ginger sample

本实验采用了LC-MS的分析方法对干姜姜辣素类化合物进行了质谱分析,其总离子流图如图3所示。同时,把5种姜辣素类化合物的标准品做了液质分析,总离子流图如图4所示,用于对比分析样品中姜辣素类化合物的成分。对干姜姜辣素样品进行正、负离子模式分析,发现姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚在负离子模式下具有较好的质谱响应,而6-姜烯酚在正离子模式下具有较高的质谱响应。所以,以负离子模式为主要结果分析姜酮、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚,而6-姜烯酚则以正离子模式为主要依据进行分析鉴定。而后,分析5个谱峰的准分子离子峰(图5)和二级质谱碎片离子峰的精确质量信息,再结合标准品总离子流图以及一、二级质谱图和相关参考相关文献对干姜中的5种化合物进行准确鉴定,结果见表3。

图3 干姜样品总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of dried ginger sample

图4 姜辣素标准品总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of gingerol standard

图5 干姜样品质谱图姜酮(1)、6-姜酚(2)、 8-姜酚(3)、6-姜烯酚(4)、10-姜酚(5)Fig.5 Mass spectrum of dried ginger samples Zingerone(1),6-gingerol(2),8-gingerol(3)，6-shogaol(4),10-gingerol(5)

表3 干姜姜辣素的HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析Table 3 Analysis of gingerols in dried ginger with HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS

图3在保留时间6.567 min附近有峰1,在m/z 193.0933产生[M-H]-峰即姜酮的特征离子峰(图5-(1)),m/z 137.0570表示的是姜辣素类化合物的主要化学成分及4′-羟基-3′-甲氧基苯官能团[11,18]。初步判定该物质为姜辣素类化合物中的一种,且分子量为194.2271。查阅CAS号可知姜酮(CAS:122-48-5)的分子量为194.23,理论值与液质测定值相差1.5×10-5,结果可信准确。由此可以得知经甲醇提取的干姜姜辣素类化合物中含有少量的姜酮,因其含量很少所以液相并没有检出,表明相对于液相色谱的检测方法,液质联用的方法灵敏度和分离度更高。

图3在保留时间8.240 min处出现分子离子峰2,在m/z 293.1770产生[M-H]-峰(图5-(2)),同样在二级质谱碎片离子峰中也出现了姜辣素类化合物的基本峰m/z 137.0488,分析可知其分子质量为294.1736,又因其出现了6-姜酚的特征离子峰m/z 293.1770可推测该物质为6-姜酚,分子式为C17H26O4。查阅Spectral Database for Organic Compounds(SDBS)和参考文献[24]可知6-姜酚的分子质量为294.4,运用本方法的实际测定值与理论值相差7.7×10-4。

图3在保留时间9.233 min处出现分子离子峰3,在m/z 321.2064出现8-姜酚特征离子峰(图5-(3)),二级质谱中发现有姜辣素类化合物的基本峰m/z 137.0489,判断其分子量为322.2073,推测该物质为8-姜酚,分子式C19H30O4。查阅SDBS可知8-姜酚的分子质量为322.4,运用本方法的实际测定值与理论值相差6.0×10-4。

图3在保留时间9.620 min处出现分子离子峰4,在m/z 277.1842产生[M+H]+峰即6-姜烯酚的特征离子峰(图5-(4)),二级质谱中存在姜辣素类化合物的基本峰m/z 137.0489,由此判断该物质为6-姜烯酚,其分子量为276.1793,分子式C17H24O3。

图3在保留时间10.246 min处出现分子离子峰5,在m/z 349.2398产生[M-H]-峰(图5-(5)),二级质谱中有姜辣素类化合物的基本峰m/z 137.0489,根据特征离子峰判断该物质为10-姜酚,其分子量为350.2378,分子式C21H34O4。查阅SDBS可知10-姜酚的分子质量为350.5,实际测定值与理论值相差7.5×10-4。

综上,LC-MS的检测方法可以检测出含量较少的姜酮,证明其灵敏度精确度要高于单独的HPLC检测。本文所述的HPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS检测方法精确度较高。并且,对比王丽等人[11]、芮雯等人[25]所用到的方法,本文的检测方法用时较少,更高效,可以更广泛地运用到其他姜制品的姜辣素检测中。

2.3 方法的线性关系及最低检出限

取混合标准品溶液适量,以色谱纯甲醇分别稀释成浓度为1、5、10、12.5、25、50、100、125、200 μg/mL的溶液,在上述液相条件下进样10 μL测定。以标准品浓度为横坐标,峰面积积分为纵坐标,进行线性分析。

姜辣素线性关系及最低检出限结果见表4,在0～200 μg/mL范围内五种姜辣素类物质得到的线性方程中R2均达到0.9992以上,表明线性关系良好。分析五种姜辣素类物质的最低检出限值,分析可知仪器状态良好,色谱方法有效可信。

表4 姜辣素线性关系及最低检出限结果(n=6)Table 4 Gingerol linear relationship and the limit of detection(n=6)

2.4 回收率与精密度

取混合标准品溶液125 μg/mL、连续进样6次,每次进样10 μL,记录其保留时间和峰面积,计算姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的峰面积的相对标准偏差RSD值来评判此方法的精密度。取同一样品溶液,按“1.2.1”方法制备供试品溶液,分别于0、2、4、8、12、24 h以10 μL进样测定,考察其是否稳定并分析保留时间和峰面积,计算姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的峰面积的相对标准偏差值评测方法的稳定性。称取已知含量的同一姜样品5份,每份约1 g,准确计算样品中姜酮、6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚的含量并分别加入相应含量的姜辣素单标对照品,按“1.2.1”方法制备供试品溶液,进样10 μL进行分析,计算其加标回收率。

如表5,由精密度实验可知:通过5种代表性姜辣素类物质的连续6次进样分析,发现其相对标准偏差RSD值较小,表明该法测定姜辣素类物质精密度良好,从而能进一步证明了本研究方法的可行性。

表5 精密度、稳定性、加标回收率实验结果(n=6)Table 5 The results of precision and stability and sample recovery rate test(n=6)

3 结论

本文建立了一种液相色谱-电喷雾-离子阱飞行时间串联质谱的方法,成功分析了干姜姜辣素类化合物中的5种主要成分,分别是姜酮、6-姜酚、6-姜烯酚、8-姜酚、10-姜酚。此方法在11 min内快速准确地分离出了5种主要的姜辣素类化合物,前处理过程简单且所需样品量少,5种姜辣素标样在设定浓度范围内均线性良好(R2≥0.9992),加标回收率均在95.48%～99.46%之间,实验重复性和仪器精密度较好。

相对比HPLC的检测方法,LC-MS的方法检测出了含量较低的姜酮,同时也准确的检测到了其他四种姜酚化合物,体现了较高的分离度和灵敏度。可以将此方法运用到更多的姜及姜类炮制品中姜辣素类化合物的检测中。

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