超临界CO2萃取阿萨伊油的 工艺优化及GC-MS分析

瞿 研,贺 成,张建军,李 伟,王小花,王林元,*

(1.北京中医药大学中药学院,北京,100029;2.北京中医药大学北京中医药研究院,北京,100029;3.北京中医药大学中医学院,北京,100029)

阿萨伊(Açaí)为棕榈科植物阿萨伊棕榈树(EuterpeoleraceaeMart.)的新鲜果实,又名巴西莓,原产于南美地区[1],在巴西、秘鲁、哥伦比亚、苏里南等地使用非常广泛[2],素有“紫色黄金”之称。目前,我国广东、香港、台湾已有少量种植。阿萨伊营养丰富,当地居民常用来果腹,同时它也具有很高的药用价值。有研究记载阿萨伊油在原产地可用来治疗痢疾[3],由果皮研磨制成的果粉可用于治疗皮肤溃疡,种子经烧烘后可制成浸液,用于治疗发烧。当地传统医学还用该植物治疗糖尿病,脱发,出血,肝炎、黄疸等肝脏疾病,肾脏疾病,疟疾,月经不调,经期疼痛和肌肉酸痛等[4]。

近10年来,阿萨伊由于良好的抗氧化能力而备受关注,以阿萨伊为原料的各类产品风靡全球。2013年阿萨伊由卫生部引入中国成为新资源食品[5]在我国使用。根据文献[6]及预实验结果,我们得知阿萨伊中油脂含量占绝大部分,同时富含花青素、原花青素等不稳定成分。目前国内外的研究均为使用有机溶剂法提取阿萨伊中的油脂类成分,该方法提取温度较高,时间长,对阿萨伊油中的不饱和脂肪酸及花青素等成分易产生破坏。因此,本文选择温度较低的超临界CO2流体萃取技术对阿萨伊油的提取工艺进行优化。前期我们已对阿萨伊油中甾醇类成分进行了分析,并建立了含量测定方法。为了更好地对阿萨伊进行系统的研究,本文采用GC-MS法对阿萨伊油进行了较为全面的定性分析,以期为阿萨伊的综合开发利用及质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阿萨伊冻干粉 蒙维(上海)贸易有限公司;14%三氟化硼-甲醇络合物、石油醚(沸点为60～90 ℃)、正庚烷、甲醇、氢氧化钠、无水硫酸钠、氯化钠 均为分析纯;二氧化碳 纯度≥99.0%,北京环宇京辉京城气体科技有限公司。

HA220-50-07型超临界CO2萃取设备 南通市华安超临界有限公司;Agilent 7890-5977B GC/MS型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司;BT-125D型电子天平 北京塞多利斯仪器系统有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超临界CO2萃取阿萨伊油条件优化

1.2.1.1 单因素实验 将阿萨伊冻干粉混合均匀,固定每次投料量为100 g,设定萃取温度为40 ℃,萃取时间60 min,分离釜Ⅰ压力为8 MPa,温度为35 ℃,分离釜Ⅱ压力为4 MPa,温度为33 ℃,考察不同的萃取压力15、20、25、30、35 MPa对油脂得率的影响;设定萃取压力为30 MPa,萃取时间60 min,分离釜Ⅰ压力为8 MPa,温度为35 ℃,分离釜Ⅱ压力为4 MPa,温度为33 ℃,考察不同的萃取温度30、35、40、45、50 ℃对油脂得率的影响;设定萃取压力为30 MPa,萃取温度40 ℃,分离釜Ⅰ压力为8 MPa,温度为35 ℃,分离釜Ⅱ压力为4 MPa,温度为33 ℃,考察不同的萃取时间30、60、90、120、180 min对油脂得率的影响。按下式计算油脂得率。

油脂得率(%)=阿萨伊出油量(g)/阿萨伊冻干粉投料量(g)×100

1.2.1.2 正交实验 在单因素实验的基础上,确定合适的因素水平,以萃取压力、萃取温度、萃取时间3个因素为考察因素,以油脂得率为考察指标,进行3因素3水平的正交实验,确定最佳工艺组合并进行直观分析与方差分析,在最优条件下进行验证实验。

表1 L9(34)正交实验因素水平表Table 1 The table of levels and factors of L9(34)orthogonal experiment

1.2.2 GC-MS分析方法

1.2.2.1 供试品甲酯化处理 样品的甲酯化采用AOAC法[7]。取阿萨伊油0.5 g置于50 mL锥形瓶中,加入6 mL 0.5 mol/L氢氧化钠-甲醇溶液,振荡混匀,水浴回流直至油滴全部溶解,再加入14%三氟化硼-甲醇溶液7 mL,继续回流30 min,继续加入5 mL正庚烷,取下冷凝器,取出烧瓶,加入饱和氯化钠溶液至锥形瓶颈部,静置,待分层清晰后取上清液,用无水硫酸钠脱水,作为分析试样。

1.2.2.2 GC-MS条件 GC条件:HP-88(100 m×0.25 mm,0.2 μm)型弹性石英毛细管色谱柱;进样口温度为240 ℃;升温程序:从100 ℃开始,保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,保持5 min,再以2 ℃/min升至240 ℃,保持10 min;载气为高纯度He,流速为1.0 mL/min;分流进样,分流比为20∶1;进样量1 μL;汽化室温度为250 ℃。MS条件:电子轰击(EI)离子源,电子能量70 eV;离子源温度230 ℃;四级杆温度为150 ℃,传输线温度240 ℃;溶剂延时9.5 min;全扫描,扫描范围m/z 45～450。采用Mass Hunter的“未知物分析”软件对该数据进行定性分析。同时采用37种混合脂肪酸甲酯标准品对组分进行验证。按峰面积归一法进行定量分析,将每一个化合物色谱峰面积所占的相对分数作为各组成化合物的质量分数。

1.3 数据处理方法

采用SPSS 20.0单因素方差、多因素方差分析进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 萃取压力对油脂得率的影响 由图1可以看出随着萃取压力增大,油脂得率也随之增加,但在25～35 MPa时油脂得率增加十分缓慢。萃取压力对超临界萃取效果有重要影响,超临界流体的密度随着压力的增加而增大,从而提高了超临界流体的溶解性能[8],但压力增加到一定程度后,超临界流体的可压缩性变小,造成油脂得率增加缓慢[8],同时考虑到安全因素(该超临界流体萃取装置的最大萃取压力为35 MPa)和设备成本,选择20、25、30 MPa作为正交实验中萃取压力的三个水平。

图1 萃取压力对油脂得率的影响Fig.1 The effect of pressure on the extraction rate of Açaí oil

2.1.2 萃取温度对油脂得率的影响 实验结果如图2所示,随着萃取温度升高,油脂得率呈现出先增长后下降的趋势。萃取温度作为超临界CO2萃取过程的另一个重要参数,升高温度对萃取得率有两种不同的影响趋势。一方面,温度升高会使分子热运动加剧,超临界流体与萃取成分的接触机会增加,同时温度升高也使传质速率提高,这些均有利于萃取;另一方面,温度升高会导致超临界流体密度降低,溶解能力下降,导致萃取率下降[9]。因此,当其它条件一定时,存在着一个相对平衡的萃取温度范围,结合实验结果,同时考虑到不破坏阿萨伊中的花青素、原花青素等不稳定成分,选择35、40、45 ℃作为正交实验中萃取温度的三个水平。

图2 萃取温度对油脂得率的影响Fig.2 The effect of temperature on the extraction rate of Açaí oil

2.1.3 萃取时间对油脂得率的影响 由图3可以看出,随着萃取时间的增加,油脂得率先缓慢增长后趋于平衡。从理论上讲,萃取时间越长,萃取越完全。但同时会增加能耗,提高成本。另一方面,若萃取时间过短,导致萃取不完全,萃取率降低。实验发现,当萃取时间大于90 min时,油脂得率几乎不变。因此,选定30、60、90 min作为正交实验中萃取时间的三个水平。

图3 萃取时间对油脂得率的影响Fig.3 The effect of times on the extraction rate of Açaí oil

2.2 正交实验设计结果与分析

根据单因素实验结果,选取L9(34)正交表进行超临界CO2流体萃取阿萨伊油正交实验,结果见表2。

表2 正交实验结果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2极差分析可知,各因素作用主次顺序为C>A>B。最佳工艺为A2B3C3,即萃取压力为25 MPa,萃取温度为45 ℃,萃取时间90 min。但由于萃取温度的2、3水平差距非常小,同时考虑到成本问题及保留阿萨伊冻干粉的活性成分,因此,选择40 ℃作为最终萃取温度。综上,确定最佳提取工艺为A2B2C3,即萃取压力为25 MPa,萃取温度为40 ℃,萃取时间90 min，阿萨伊油得率为54.871%。

按优选的工艺进行验证实验,当各项参数达设定值时开始萃取,平行操作3次,出油率分别为54.802%、52.507%和53.625%,RSD值为2.139%,与正交结果相符,表明该工艺稳定可行。

2.3 阿萨伊油的组成分析

采用GC-MS技术对阿萨伊油进行检测,得到阿萨伊油的总离子流图(见图4),所得质谱图经计算机质谱数据库NIST14检索,确定了样品中谱库匹配得分>70的34个化合物。其结果见表3。

表3 阿萨伊油气质联用分析结果Table 3 The results of GC-MS analysis of Açaí oil

图4 阿萨伊油的离子流图Fig.4 Total ion chromatography of Açaí oil

由表3可知,阿萨伊油中成分主要为烷烃类、不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸,另外,还含有少量的酮、醇等。

传统的提取油脂类成分的方法,如索氏提取、有机溶剂萃取等,时间较长、产品纯度不高,易残留有害溶剂[10]。超临界CO2流体萃取技术是以超临界CO2流体为萃取剂,在临界温度与压力条件下,从流体或固体物料中获取分离组分的方法[11]。该技术提取率高、产品纯度好、流程简单,适合不稳定、易氧化的挥发性成分和脂溶性成分的提取分离,为有效成分的提取提供了更好的方法[12]。近年来,超临界CO2流体萃取技术发展迅速,已广泛应用于植物药的提取。阿萨伊富含花青素、原花青素等不稳定成分[13],在光线、热、氧气等存在情况下易发生变化。因此,本文选用超临界CO2流体萃取法提取阿萨伊油,不仅可以防止油类成分受到破坏,同时可以最大限度的确保对其它成分的分析利用。

脂肪酸分为饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。营养学和生物临床医学研究认为,脂肪酸在维持人体健康方面起着重要的作用,饮食中长链脂肪酸的组成及含量与各种疾病(如肿瘤、冠心病、心脑血管病和老年痴呆症等)的发病率呈正相关性[14-16]。因此,脂肪酸的组成和含量也就成为衡量其营养价值的最重要指标。从膳食中脂肪酸的平衡角度来说,中国营养学会建议,食用油脂中饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)的比例以1∶1∶1为宜,日本的推荐标准是3∶4∶3。对于多不饱和脂肪酸中w-6型和w-3型脂肪酸的比例,营养学家提出,小于4∶1的理想比值是有益于保障人体健康的脂肪酸平衡模式[17]。ω-3脂肪酸具有防止动脉硬化,降低血压,活化大脑细胞,防止老年痴呆病等优点,当ω-6脂肪酸相对于ω-3脂肪酸过多时,会合成人体的炎症因子[18]。实验结果表明,阿萨伊中主要成分为油酸、棕榈酸、亚油酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚麻酸,相对百分含量分别为43.419%、19.028%、14.328%、6.702%、6.123%、2.067%,占总含量的92.855%。其中棕榈酸、硬脂酸为饱和脂肪酸,棕榈油酸、油酸为单不饱和脂肪酸,亚麻酸为ω-3型多不饱和脂肪酸,亚油酸为ω-6型多不饱和脂肪酸。具体见表4。其饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸的构成比例为0.49∶1∶0.31。ω-6型与ω-3型多不饱和脂肪酸比例为6.93∶1,基本符合膳食平衡标准。

表4 阿萨伊油中脂肪酸的分类Table 4 The classification of fatty acids in Açaí

橄榄油由于营养成分丰富、保健功能突出而被公认为绿色保健食用油,具有预防心脑血管疾病、糖尿病、防癌、抗衰老等功能,在西方有“植物油皇后”“液体黄金”之美称。油茶籽油是我国特有的一种高级食用油,享有“油中珍品”的美称。它富含单不饱和脂肪酸,其脂肪酸组成与橄榄油相似,有“东方橄榄油”之称[19]。根据文献统计[20],橄榄油与油茶籽油的主要成分见表5。与这两种油相比,阿萨伊油中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸比例更加均衡,其亚麻酸含量较橄榄油及油茶籽油偏高,更加有利于人体健康。

表5 橄榄油、油茶籽油及阿萨伊油的组成对比Table 5 The composition of olive oil，camellia seed oil and Açaí oil

3 结论

超临界CO2流体萃取阿萨伊油的最佳提取工艺为萃取压力为25 MPa,萃取温度为40 ℃,萃取时间90 min,此时得率为54.871%。

经GC-MS分析,阿萨伊油中共分离鉴定出34种化合物,其中含量较高的为油酸、棕榈酸、亚油酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚麻酸,质量分数分别为44.607%、19.028%、14.328%、6.702%、6.123%、2.067%。

阿萨伊作为一种南美常用草药,是一种纯天然的药食两用资源,可应用于食品、医药、添加剂等领域[13],符合现代的消费理念、营养需求及发展趋势。本研究对阿萨伊的油脂类成分进行了较为系统的研究,为阿萨伊的综合开发利用及质量评价提供了理论依据,为后期药效实验的开展及探讨成分与药效的相关性奠定基础。

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