醛固酮瘤细胞原代培养方法的建立及细胞鉴定

王 芬，童安莉，李玉秀

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 内分泌科 卫生部重点实验室，北京 100730)

原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism，PA)是继发性高血压最常见的原因，约占继发性高血压的10%[1- 2]。其中，醛固酮腺瘤(aldosterone producing adenoma，APA)为PA的第二大病因，早期手术治疗可治愈。40%～65%的APA存在体系突变[3- 5]， 即KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1和CACNA1D基因突变，但仍有50%的肿瘤致病基因不明。

醛固酮瘤细胞的原代培养对研究肿瘤的致病背景及下游功能有十分重要的作用。然而，大部分醛固酮瘤直径在2 cm以内，这对醛固酮瘤细胞的原代培养造成了很大的困难。目前国际上仅有个别文献报道了APA的原代培养[6- 7]，国内尚无相关报道。本研究的目的即是建立醛固酮瘤细胞的原代培养方法及培养细胞的鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

Ⅰ型胶原酶(Gibco公司)；DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；标准级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素(×100)、1×PBS和红细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠抗人醛固酮合成酶(human aldosterone synthase，即CYP11B2)抗体(密西西比大学医学中心Celso Gomez-Sanchez教授赠送)；醛固酮放免法试剂盒(北方生物技术研究所)；ITS+1(Sigma公司)；山羊抗鼠IgG(Alexa594)(Abcam公司)；抗荧光淬灭封片剂(Thermo-Fisher公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色液(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(碧云天生物技术公司)。

病例选择：选择临床上诊断为APA(6例)、肾上腺无功能瘤(1例)、皮质醇瘤(1例)的患者新鲜切除的肿瘤组织样本。该研究均获得患者的知情同意及北京协和医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 用DMEM/F12培养基将手术切除的新鲜的人醛固酮瘤组织(约0.7 cm×0.6 cm×0.3 cm)轻轻冲洗1遍。用眼科镊及眼科剪辅助去掉组织包膜。将组织剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，加入2 g/L的Ⅰ型胶原酶8 mL，用吸管吹打数次，放入37 ℃水浴锅中消化2 h。期间每隔30 min用吸管吹打数次。加入3倍体积的红细胞裂解液，4 ℃放置10 min。1 500 r/min离心5 min。去掉上清，洗细胞2次后用完全培养基(DMEM/F12+10% FBS+1% ITS+1+1%青链霉素)重悬。用200目尼龙网过滤细胞悬液。台盼兰染色证明活细胞达90%以上。用细胞计数板计数，调整细胞数目至16 × 104个/mL种于24孔板，调整细胞数目至3×104个/mL种至96孔板及细胞爬片，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 原代培养人肾上腺无功能腺瘤(non-functioning adrenal tumor, NFAT)及人肾上腺皮质醇瘤(cortisol producing adenoma, CPA)细胞：方法同上。

1.2.3 原代培养的醛固酮瘤细胞的分泌功能鉴定

1)细胞培养液中醛固酮浓度的测定:培养至第3 天，更换新鲜的完全培养基。培养至第5天，收集细胞孔的培养液，-20 ℃冻存。用放免法试剂盒测定培养液中醛固酮浓度。如浓度过高则用DMEM/F12培养基稀释后测定。

2)细胞内CYP11B2表达的检测:培养至第5 天，取细胞爬片，用PBS洗3遍，用4%的多聚甲醛室温固定20 min，吸去多聚甲醛溶液，PBS再洗3次，每次3 min。用1∶200小鼠抗人CYP11B2抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗3遍后用山羊抗鼠IgG(Alexa594)标记的二抗室温孵育30 min。PBS洗3次后用1∶1 000的DAPI染色15 min。加荧光淬灭剂于爬片上，封片后置于共聚焦显微镜观察。倒置相差显微镜观察细胞形态，确定培养时间-细胞分泌功能曲线。

1.2.4 细胞形态的观察及培养时间-细胞分泌功能曲线的确定：在倒置显微镜下观察细胞的形态并拍照。每天换液，保留培养第1～7天和第11天的培养液，测定醛固酮水平，制备醛固酮分泌水平的时间曲线。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 原代培养的APA、CPA和NFAT细胞的形态

共成功培养6个APA(n=6)、1个NFAT(n=1)和1个CPA(n=1)组织，每例肿瘤种板3个孔(n=3)。 APA和NFAT组织呈金黄色，CPA组织呈棕黄色。APA细胞培养24 h，细胞基本贴壁，大部分细胞为圆形。72 h之后，APA细胞贴壁更牢固并伸展，少部分呈三角形或不规则形。NFAT的细胞形态与APA十分相近。CPA细胞胞质较清亮，细胞偏小(图1)。

2.2 原代培养的APA细胞分泌功能

在相同的细胞种板数量及培养条件下，在培养第5 天时，APA细胞培养液中醛固酮浓度为(30.0±8.9) nmol/L；NFAT细胞培养液的醛固酮浓度为(1.4±0.2)nmol/L；CPA细胞培养液的醛固酮浓度为(0.4±0.1)nmol/L。APA细胞培养液中的醛固酮浓度明显高于NFAT和CPA细胞。

A～E.APA cells in culture day 1(A), day 2(B), day 3(C), day 4(D) and day 5(E); F.(×400) is the enlarged view of B; G.NFAT cells; H.CPA cells

图1光镜下细胞形态

Fig1Cellmorphologyunderlightmicroscope(×100)

原代培养的APA细胞的培养液中检测到的醛固酮浓度在培养第1天最高，随后下降，在第4～11天内大致持平(图2)。

图2 原代培养的APA细胞的分泌功能曲线Fig 2 Secretary curve of APA cells in primary culture

2.3 原代培养的APA细胞中CYP11B2表达

原代培养的APA细胞中CYP11B2免疫荧光阳性(图3)。

Blue.DAPI immunostaining; red.CYP11B2 immunostaining

3 讨论

本实验成功培养了人APA原代细胞，并观察了APA细胞在光镜下的形态。细胞培养液的醛固酮水平及CYP11B2的染色结果均提示培养细胞为分泌醛固酮的腺瘤细胞。在体外培养中，APA细胞增殖良好，培养11 d内均保持分泌功能。APA细胞分泌醛固酮的功能显著高于NFAT细胞和CPA细胞。

APA细胞体外培养非常困难，且APA肿瘤组织小，能获得的组织少。国外仅有数篇报道，国内尚未建立该培养方法。本研究从以下两方面优化培养方法：1)由于APA细胞脂滴含量多，细胞密度小，在常规离心速度(800 r/min)之下会丢失大量细胞，离心速度加大至1 500 r/min(360×g)时能得到更多的细胞；2)过量的红细胞可能会影响APA细胞的贴壁。用红细胞裂解液将红细胞破碎，这样能减少红细胞对贴壁的影响。

APA主要存在KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1和CACNA1D这4种体系突变。在伴有低钾血症的APA患者中，KCNJ5的突变率可高达73.7%[8]。上述突变能升高细胞内钙离子浓度[9- 10]，促进醛固酮合成，但钙离子下游信号并不清楚。目前常用人肾上腺皮质癌细胞系(如H295R细胞系和HAC15细胞系)研究球状带功能，但这两个细胞系分泌醛固酮的能力较醛固酮瘤差距仍较远[11]。将KCNJ5基因转入H295R细胞系可研究下一步功能。但多数KCNJ5基因致病位点对细胞毒性大，细胞会因大量钠离子内流而死亡[9]。有意思的是，携带相同突变位点的原代细胞却能在体外环境下生存。因此，APA原代细胞培养是研究下游信号通路的有力工具。

综上所述，本实验成功建立了APA细胞的原代培养方法，国内尚无相关报道。APA细胞原代培养方法的建立对研究该肿瘤的发病机制及肿瘤细胞功能具有重要意义。

：

[1] Funder JW, Carey RM, Mantero F,etal. The manage-ment of primary aldosteronism: case detection, diagnosis, and treatment: an endocrine society clinical practice guideline [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2016, 101: 1889- 1916.

[2] Mulatero P, Stowasser M, Loh KC,etal. Increased diagnosis of primary aldosteronism, including surgically correctable forms, in centers from five continents [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89: 1045- 1050.

[3] Azizan EA, Lam BY, Newhouse SJ,etal. Microarray, qPCR, and KCNJ5 sequencing of aldosterone-producing adenomas reveal differences in genotype and phenotype between zona glomerulosa-and zona fasciculata-like tumors [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012, 97: 819- 829.

[4] Monticone S, Hattangady NG, Nishimoto K,etal. Effect of KCNJ5 mutations on gene expression in aldosterone-producing adenomas and adrenocortical cells [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012, 97: 1567- 1572.

[5] Åkerström T, Crona J, Delgado VA,etal. Comprehen-sive re-sequencing of adrenal aldosterone producing les-ions reveal three somatic mutations near the KCNJ5 potassium channel selectivity filter [J]. PLoS One, 2012, 7: e41926. doi: 10.1371/journal.pone.0041926.

[6] Caroccia B, Prisco S, Seccia TM,etal. Macrolides blunt aldosterone biosynthesis: a proof-of-concept study in KCNJ5 mutated adenoma cells ex vivo [J]. Hypertension, 2017, 70: 1238- 1242.

[7] Beuschlein F, Boulkroun S, Osswald A,etal. Somatic mutations in ATP1A1 and ATP2B3 lead to aldosterone-producing adenomas and secondary hypertension [J]. Nat Genet, 2013, 45: 440- 444, 444e1- 2.

[8] Taguchi R, Yamada M, Nakajima Y,etal. Expression and mutations of KCNJ5 mRNA in Japanese patients with aldosterone-producing adenomas [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2012, 97: 1311- 1319.

[9] Scholl UI, Nelson-Williams C, Yue P,etal. Hyperten-sion with or without adrenal hyperplasia due to different inherited mutations in the potassium channel KCNJ5 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012, 109: 2533- 2538.

[10] Choi M, Scholl UI, Yue P,etal. K+channel mutations in adrenal aldosterone-producing adenomas and hereditary hypertension [J]. Science, 2011, 331: 768- 772.

[11] 李春艳, 童安莉, 王芬, 等. 辛伐他汀对血管紧张素Ⅱ 刺激的肾上腺皮质癌H295R细胞的分泌和增殖的影响 [J]. 基础医学与临床, 2017, 37: 346- 350.