SIRT6招募mRNA结合蛋白IMP1调控IGF2在293T细胞表达

王婷婷，吴 洁，董海涛，徐 徕，肖 毅*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.中心实验室； 2.检验科； 3.口腔科；4.基本外科，北京 100730)

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)在肿瘤的发生发展中具有重要作用[1]。IGF2的高表达和肿瘤较差的预后紧密相关，动物实验表明，过表达IGF2使个体胸腺腺癌、肺癌等肿瘤的发病率显著增加[2- 3]。在间质瘤中IGF2表达也显著增加[4]。机制方面， IGF2可以调节细胞增殖、分化和细胞代谢，在胚胎发育中可以促进胚胎生长发育[5]。IGF2的转录水平受到基因组印记基因的调节，一般通过来源于母本等位基因的差异甲基化区域的基因甲基化参与调控， 这种调节模式约占该基因转录调控的66%[6]，但IGF2在转录后的调节机制迄今仍然不是很清楚。

SIRT6是NAD+依赖的III类组蛋白去乙酰化酶Sirtuins(SIRT1- 7)家族中的一员，在衰老和肿瘤发生中发挥重要作用[7- 8]。以往研究显示，SIRT6敲除小鼠在肝脏和心脏组织中都观察到IGF2的表达上升[9- 10]，同时，过表达SIRT6后，IGF2表达水平显著下降[11]。并且上述研究均表明，在SIRT6缺失的情况下，IGF2的蛋白和mRNA水平上升程度不同，因此提示可能存在其他因素影响IGF2 mRNA的转录后调节。

本研究通过在293T细胞系中过表达SIRT6以及用免疫共沉淀方法富集所有可能与SIRT6相互作用的蛋白，并进一步质谱鉴定这些可能的相互作用蛋白，深入探讨SIRT6对IGF2可能的转录后调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

293T细胞系(上海吉凯基因)；DPBS、trypsin-EDTA和 lipo2000 (Invitrogen公司)；DMEM基础培养基和FBS(Gibco公司)；限制性核酸内切酶(NEB公司)；过表达载体体系(Addgene公司)；牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司)；SIRT6抗体、IMP1抗体、MYC标签抗体、FLAG标签抗体、磷酸化抗体、乙酰化抗体(Abcam公司)。RNA反转录系统所用酶和试剂(TaKaRa公司);Trizol(Thermo公司);免疫共沉淀细胞裂解液(上海碧云天生物技术公司)；IgG(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.2 方法

1.2.1 过表达载体的构建：从人基因组cDNA上分别扩增出SIRT6和IMP1，设计SIRT6的PCR上下游引物:SIRT6-P1: 5′-GCCGCGTAATTCACCGA CATCTTCCAACTGCCTCTCTGGC-3′， SIRT6-P2:5′-A AGGCCAAGGCGGTCCCCAGCTGCTCGAGTCTAGAGG GC-3′。因为构建SIRT6过表达载体用质粒pcDNA4/myc-his，选择用限制性内切酶HindⅢ/EcoRⅠ酶切，所以设计扩增引物时带上载体的同源臂序列。IMP1的上下游引物设计如下:IMP1-P1:5′-TTGC CGATGTAAAGCTTGTTCATGAATTCCTGCAGCCCGG GGGAT-3′,IMP1-P2:5′-TACCGGGCCCCCCCTCGA GGTCGACTTACTTCCTCCGTGCCTGGG-3′。构建IMP1过表达载体的质粒pCMV-Tag2B，用限制性内切酶SalⅠ/EcoRⅠ酶切。利用上述引物进行PCR扩增，产物经2% 琼脂凝胶电泳回收目的基因片段，用相应内切酶分别切割两种质粒，用In-fusion TM PCR克隆反应体系42 ℃连接15 min。产物转化DH5α感受态细胞对抗性克隆进行测序分析，将正确克隆菌液扩大培养、抽提。

1.2.2 脂质体转染法过表达载体：两种载体过表达均采用lipo2000脂质体转染的方式，具体转染方法按照说明书，转染到293T细胞。293T细胞转染效率高，是研究基因/蛋白功能的理想工具细胞系。本研究主要探讨SIRT6对IGF2的转录后调节机制，应用293T细胞方便相关基因过表达以及后续的免疫共沉淀和质谱实验。

1.2.3 蛋白质免疫共沉淀(immunoprecipitation，IP)：1)细胞裂解，离心收集培养好的293T细胞，加入1 mL IP细胞裂解液，冰上放置30 min后，离心吸取上清，即为所需的蛋白提取物。2)免疫与沉淀，将上述的蛋白提取物中加入30 μL的蛋白质A琼脂糖珠，同时加入4 μg IgG和10 μL的牛血清白蛋白，于4 ℃轻摇1～2 h，预处理以降低非特异的结合。离心取上清至新离心管中，将上清分为2份，一份加入4 μg特异抗体，另一份加入4 μg IgG 作为阴性对照，于4 ℃轻摇孵育过夜。同时取两份30 μL蛋白质A琼脂糖珠，每份均加入1 mL IP细胞裂解液和10 μL BSA，于4 ℃轻微摇动孵育过夜。次日，先将30 μL的蛋白质A琼脂糖珠于4 ℃离心去上清。再将分别与特异抗体和IgG孵育过夜的蛋白提取物加入处理好的30 μL蛋白质A琼脂糖珠, 4 ℃轻摇2～3 h，离心弃上清，沉淀用预冷的IP细胞裂解液洗4～6次，离心。最后加入2×蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，吸上清，即为IP后的蛋白样。

1.2.4 蛋白样IP富集后质谱鉴定分析：将IP后的蛋白样行电泳，之后切胶提取蛋白，样品上机，质谱分析与SIRT6直接相互作用的蛋白。

1.2.5 Western blot检测IP后蛋白样：将所得到的蛋白上清上样，进行SDS-PAGE电泳，然后用另一种蛋白的抗体孵育，如果能得到特异性条带，而阴性对照(IgG)没有带，说明两种蛋白可以直接相互作用。用特异性修饰的抗体孵育，如果能得到特异性条带，说明所检测的蛋白具有该种修饰。本实验用磷酸化和乙酰化修饰抗体孵育。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 质谱发现SIRT6和IMP1存在相互作用

如流程图(图1)所示，IP MYC标签的SIRT6后考马斯亮蓝染色显示，在IP-MYC组有诱饵蛋白SIRT6(41 ku)的大量富集，同时观察到，相比于阴性对照组,IP-MYC组有多条特异条带出现(图2)，提示SIRT6可能有多种相互作用蛋白。通过切胶质谱鉴定发现，在前100位候选蛋白中，有多个RNA结合蛋白，并且发现IGF2的mRNA结合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1，IMP1)被显著富集。

图1 过表达SIRT6后IP/质谱鉴定流程图Fig 1 Flowchart of overexpression of SIRT6 and IP/mass spectrometry identification

图2 IP MYC标签的SIRT6 后的电泳结果Fig 2 Electrophoresis results after IP the protein of MYC-SIRT6

2.2 蛋白质免疫共沉淀验证SIRT6和IMP1的相互作用

随后用IP-Western blot方法对质谱结果进行验证，过表达MYC-SIRT6和Flag-IMP1载体，用MYC抗体进行IP实验，Western blot结果可看到相应位置有IMP1特异性条带(图3)，说明富集到的SIRT6可直接募集IMP1。

图3 IP MYC标签的SIRT6后Western blot检测IMP1和MYC结果Fig 3 Western blot results of IMP1 and MYC after IP MYC-SIRT6

2.3 SIRT6可以影响IMP1的磷酸化

在293T细胞中过表达Flag-IMP1载体，同时过表达MYC标签的SIRT6或GFP对照质粒结果显示，过表达SIRT6能明显促进IMP1的磷酸化水平，但对其乙酰化水平影响不大(图4)。

3 讨论

通过在工具细胞系293T细胞中过表达SIRT6以及用免疫共沉淀方法富集所有可能与SIRT6相互作用的蛋白，并进一步质谱鉴定这些可能的相互作用蛋白，发现IGF2的mRNA调节蛋白1(IMP1)被显著富集。并通过免疫共沉淀/Westen blot等方法，进一步明确SIRT6可能通过IMP1对细胞中IGF2起调控作用。

以往的研究表明，在SIRT6缺失的情况下，IGF2的蛋白水平和mRNA水平有不同程度上升，因此提示可能存在其他因素影响IGF2的mRNA转录后调节[9- 10]。最新研究提示，SIRT6可直接调节RNA结合蛋白Lin28的表达，参与胰腺癌的发生发展[12]。因此SIRT6很有可能参与调节多种RNA结合蛋白的功能。

IMP1作为一种mRNA结合蛋白，在肿瘤中可以促进上皮间质转换，促进肿瘤发生和转移[13]，其作用模式一般是通过结合靶mRNA，同时又可以作为一个接头蛋白，募集RNA降解相关蛋白，从而促进靶mRNA的降解[14]。在本研究中，SIRT6可能通过和IMP1结合，促进IMP1的磷酸化，来进一步促进IMP1对靶基因IGF2 mRNA的降解调控。

A.Western blot results; B.relative protein level of IMP1 acetylation and phosphorylation;*P<0.05 compared with Con+Flag-IMP1 group

图4Westernblot检测SIRT6是否过表达对IMP1磷酸化和乙酰化修饰的影响

本研究通过免疫共沉淀结合质谱实验，首次报道了SIRT6可以和IGF2 mRNA结合蛋白(IMP1)相互作用，并影响IMP1的磷酸化水平，阐述了一种除印记基因调节之外的新的IGF2被调节方式，为进一步研究IGF2的调节模式提供了理论依据。

：

[1] Livingstone C. Igf2 and cancer[J]. Endocr Relat Cancer, 2013, 20: 321- 339.

[2] Bates P, Fisher R, Ward A,etal. Mammary cancer in transgenic mice expressing insulin-like growth factor ii (igf-ii) [J]. Br J Cancer, 1995, 72: 1189- 1193.

[3] Moorehead RA, Sanchez OH, Baldwin RM,etal. Transgenic overexpression of igf-ii induces spontaneous lung tumors: A model for human lung adenocarcinoma[J]. Oncogene, 2003, 22: 853- 857.

[4] Steigen SE, Schaeffer DF, West RB,etal. Expression of insulin-like growth factor 2 in mesenchymal neoplasms[J]. Mod Pathol, 2009, 22: 914- 921.

[5] Ha WT, Jeong HY, Lee SY,etal. Effects of the insulin-like growth factor pathway on the regulation of mammary gland development[J]. Dev Reprod, 2016, 20: 179- 185.

[6] Harrela M, Koistinen H, Kaprio J,etal. Genetic and environmental components of interindividual variation in circulating levels of igf-i, igf-ii, igfbp- 1, and igfbp- 3[J]. J Clin Invest, 1996, 98: 2612- 2615.

[7] Kugel S， Mostoslavsky R. Chromatin and beyond: The multitasking roles for sirt6[J]. Trends Biochem Sci, 2014, 39: 72- 81.

[8] Mostoslavsky R, Chua KF, Lombard DB,etal. Genomic instability and aging-like phenotype in the absence of mammalian sirt6[J]. Cell, 2006, 124: 315- 329.

[9] Marquardt JU, Fischer K, Baus K,etal. Sirtuin- 6-dependent genetic and epigenetic alterations are associated with poor clinical outcome in hepatocellular carcinoma patients[J]. Hepatology, 2013, 58: 1054- 1064.

[10] Webster KA. A sirtuin link between metabolism and heart disease[J]. Nat Med, 2012, 18: 1617- 1619.

[11] Yin X, Gao Y, Shi HS,etal. Overexpression of sirt6 in the hippocampal ca1 impairs the formation of long-term contextual fear memory[J]. Sci Rep, 2016, 6: 18982. doi: 10.1038/srep18982.

[12] Kugel S, Sebastian C, Fitamant J,etal. Sirt6 suppresses pancreatic cancer through control of lin28b[J]. Cell, 2016, 165: 1401- 1415.

[13] Zirkel A, Lederer M, Stohr N,etal. Igf2bp1 promotes mesenchymal cell properties and migration of tumor-derived cells by enhancing the expression of lef1 and snai2 (slug) [J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41: 6618- 6636.

[14] Bell JL, Wachter K, Muhleck B,etal. Insulin-like growth factor 2 mrna-binding proteins (igf2bps): Post-transcriptional drivers of cancer progression[J]. Cell Mol Life Sci, 2013, 70: 2657- 2675.