Twist促进人三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭

张达容，王维莲，吴立翔，柳满然

(1.重庆大学附属肿瘤医院 重庆市肿瘤研究所 重庆市肿瘤医院 检验科，重庆 400030；2.武警重庆市总队医院检验科，重庆 400061； 3.重庆医科大学 检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室， 重庆 400016)

乳腺癌是女性中最多见的恶性肿瘤。根据2017年最新的统计数据，乳腺癌在美国女性全部新发癌症所占比例为30%，而因乳腺癌死亡患者占全部因癌死亡患者的14%，为第二死亡病因，仅次于肺癌[1]。其中乳腺癌患者治疗后复发转移是其死亡的主要原因[2]。侵袭和转移是恶性肿瘤的本质特征，也是肿瘤治疗学所面临的最具挑战的问题，因此，进一步阐明肿瘤侵袭和转移的分子机制是制定新的治疗方案的理论基础。近年来研究发现，Twist基因可诱导细胞发生上皮间质转换(epithelial to mesenchymal transition, EMT),促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[3- 4]，但其在乳腺癌中的具体作用尚有待进一步研究。本研究首先通过慢病毒技术，靶向沉默人三阴性乳腺癌细胞Hs578TTwist基因的表达，然后进一步研究Twist基因沉默对人三阴性乳腺癌细胞Hs578T迁移和侵袭能力的影响，并初步探讨其潜在的机制，这为深入研究Twist基因在三阴性乳腺癌细胞中的具体作用提供了一定基础和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人三阴性乳腺癌细胞Hs578T(由本实验室保存)。RPMI1640培养基和胎牛血清(Gibco公司)；Trizol和PCR引物(Invitrogen公司)；反转录试剂盒和PCR试剂(TaKaRa公司)； RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；鼠抗人Twist蛋白单克隆抗体(Abcam公司)；兔抗人p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗小鼠/兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；ECL化学发光试剂(Bio-Rad公司)；基质胶(BD Biosciences公司)；Tanswell小室(Millipore公司)；包含Twist基因特异性干扰序列(5′-AAGCTGAGC AAGATTCAGACC-3′)和阴性对照序列的慢病毒载体(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 贴壁培养细胞：将人三阴性乳腺癌细胞Hs578T用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，所有细胞均置于37 ℃、5% CO2无菌恒温培养箱中传代培养。

1.2.2 慢病毒载体包装及细胞转染：参照本实验室方法[5]，转染构建人三阴性乳腺癌细胞Hs578TTwist基因靶向沉默细胞系(shTwist)、阴性对照细胞系(shNC)和空白对照组(blank)，并利用倒置荧光显微镜观察细胞转染效率。

1.2.3 RT-qPCR检测各组细胞TwistmRNA表达水平：待细胞增殖至80%汇合度时，采用Trizol试剂提取shTwist组细胞、shNC组细胞和blank组细胞的总RNA，利用反转录试剂盒反转录cDNA。采用SYBR Green法进行RT-qPCR检测，Twist基因引物序列为：上游5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。反应体系：95 ℃预变性30 s, 95 ℃变性10 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸20 s，40个循环。

1.2.4 Western blot检测各组细胞Twist蛋白及AKT/ERK信号通路蛋白表达水平：待细胞增殖至80%汇合度时，收集shTwist组细胞、shNC组细胞和blank组细胞，利用RIPA蛋白裂解液裂解各组细胞，通过BCA蛋白定量检测试剂盒测定各组细胞蛋白浓度，经12% SDS-PAGE胶分离蛋白，一抗(Twist、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin)1∶1 000稀释置于4 ℃冰箱孵育过夜，然后将HRP标记二抗(山羊抗兔，山羊抗鼠)1∶1 000稀释置于室温孵育1 h，ECL试剂发光显色，凝胶成像分析仪采集图像。

1.2.5 Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力：沿用本实验室操作方法[6]，其中加入各组细胞量为3×104个细胞，培养时间为8 h。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 成功构建Twist稳定沉默细胞系

shTwist组细胞和shNC组细胞荧光比例均达到95%以上，而对照组(blank)无荧光表达(图1)。

与阴性对照组(shNC)和对照组(blank)细胞相比，shTwist组细胞TwistmRNA(P<0.05)(图2A)和蛋白(P<0.05)(图2B)表达水平显著降低。

2.2 Twist基因沉默抑制人三阴性乳腺癌细胞Hs578T迁移和侵袭能力

与阴性对照组(shNC)和对照组(blank)细胞相比，shTwist组细胞的迁移和侵袭细胞数明显增高(P<0.05，P<0.05)(图3)。

2.3 Twist基因沉默下调AKT/ERK信号通路蛋白表达

与阴性对照组(shNC)和对照组(blank)细胞相比，shTwist组细胞的p-AKT和p-ERK1/2蛋白表达显著下降(P<0.05，P<0.05)(图4)。

图1 倒置荧光显微镜观察各组细胞荧光表达Fig 1 Expression of fluorescence protein in different groups (scale bars=200 μm)

A.Twist mRNA expression levels; B&C.Twist protein expression levels; *P<0.05 compared with blank and shNC group图2 RT-qPCR和Western blot检测Twist mRNA和蛋白水平的表达Fig 2 Expression of Twist mRNA and protein in different n=3)

*P<0.05 compared with blank and shNC group图3 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力Fig 3 Abilities of cell migration and invasion in different groups (scale bars=200 μm)

*P<0.05 compared with blank and shNC group图4 Western blot检测AKT/ERK信号通路蛋白的表达Fig 4 Expression of AKT/ERK signaling pathway proteins in different n=3)

3 讨论

全球乳腺癌发病率一直处于上升趋势，在中国乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤第一位[7]。由于三阴性乳腺癌患者迄今未见确切有效的临床靶向药物，且具有更高的5年内复发和转移风险[8]，因此，三阴性乳腺癌的防治研究成了近期乳腺肿瘤研究中的热点及难点，探讨其侵袭转移的分子机制对其防治具有重要意义。

本研究选取具有高迁移和侵袭能力的三阴性乳腺癌细胞Hs578T作为研究对象，通过慢病毒技术携带特异性Twist干扰RNA，靶向沉默Twist基因的表达，通过检测细胞荧光表达情况以及TwistmRNA和蛋白表达水平，证实成功构建Twist基因稳定沉默的Hs578T细胞系。然后通过Transwell迁移和侵袭实验，检测Twist基因稳定沉默后细胞迁移和侵袭能力变化，发现Twist基因沉默可以显著降低细胞迁移和侵袭能力。为了进一步研究其潜在的分子机制，本研究检测了AKT和ERK信号通路的变化，结果表明Twist基因稳定沉默后p-ERK1/2和p-AKT表达水平明显降低，说明AKT和ERK信号通路可能参与Twist介导的三阴性乳腺癌细胞迁移和侵袭过程。但是否还有其他信号通路参与其中，以及Twist具体作用机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究通过shRNA介导的慢病毒技术成功建立Twist基因稳定沉默细胞系，证实Twist基因沉默可以明显抑制三阴性乳腺癌细胞Hs578T的迁移和侵袭能力，初步证实Twist可能通过AKT和ERK信号通路调控三阴性乳腺癌细胞Hs578T的迁移和侵袭。本研究构建了良好的细胞模型，为进一步深入研究Twist促肿瘤的具体作用机制奠定了一定的实验基础。

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