广泛耐药铜绿假单胞菌甲基化酶基因的检测和基因周边结构分析

袁瑾懿 ， 余 慧， 郭 燕， 徐晓刚

铜绿假单胞菌等革兰阴性菌耐药现象日益严重，已出现对常用抗菌药物不敏感的广泛耐药（extensively drug resistant，XDR）菌株，成为全球关注焦点[1]。氨基糖苷类抗生素被广泛应用于临床，在耐药革兰阴性菌、尤其是铜绿假单胞菌所致感染的抗菌治疗中，是联合用药的重要品种之一[2]。氨基糖苷类钝化酶广泛分布在革兰阳性和革兰阴性细菌，通过修饰氨基糖苷类的特定活性部位、影响药物与靶位结合，导致细菌对特定的氨基糖苷类耐药，曾被认为是细菌对氨基糖苷类抗生素耐药的主要机制[3]。近年法国和日本学者先后发现了一系列由质粒介导的新的耐药机制——16S rRNA甲基化酶（rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA等基因编码）[4-9]。这些基因位于质粒或转座子上，易于传播，成为抗感染治疗的重要课题。

本课题组曾报道在上海地区铜绿假单胞菌临床分离株中首次检出16S rRNA甲基化酶基因armA及rmtB[10]。16S rRNA甲基化酶阳性菌株多为多重耐药或泛耐药菌株，提示此类耐药菌株中存在甲基化酶基因传播。因此，我们补充收集了59株XDR铜绿假单胞菌，就菌株同源性、16S rRNA甲基化酶基因分布及此类耐药基因周边结构进行了分析，以进一步认识16S rRNA甲基化酶基因在铜绿假单胞菌中的传播机制，并为此类耐药细菌所致医院感染的预防与控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集复旦大学附属华山医院2005－2006年临床分离的、纸片扩散法判定为XDR的铜绿假单胞菌，剔除同一患者分离的重复菌株，共59株。XDR定义为对所有常用抗菌药物（除多黏菌素）均耐药。大肠埃希菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。质控菌株均为华山医院抗生素研究所临床微生物室保存菌株。

1.1.2 主要药物和生化试剂 限制性内切酶（BamHI、EcoRI及HindIII），T4连接酶、rTaq酶等分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MIC测定 采用琼脂稀释法测定庆大霉素和阿米卡星对铜绿假单胞菌的MIC，按 CLSI 2016标准[11]判读结果。

1.2.2 16S rRNA甲基化酶基因检测及ERIC-PCR分型 参考文献 [4-10， 12]设计引物并进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3 16S rRNA甲基化酶基因周边序列分析 随机选取ERIC-PCR分型为D型，编号为HSPA 23（rmtB阳性）、HSPA 26（armA阳性）临床株用于周边序列分析，转种临床株以及含pUC18的大肠埃希菌DH5α，抽提质粒，使用限制性内切酶BamHI、EcoRI及HindIII分别酶切各质粒，使用T4连接酶连接临床株野生质粒与pUC18质粒的酶切产物。实验参考《分子克隆实验指南》，并按相关试剂盒说明书操作。

连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞后，涂布于含100 mg/L庆大霉素的LB平皿，获得转化子经PCR确认后质粒送上海生工生物工程公司测序，序列与GenBank序列进行比对、分析。

1.2.4 统计学方法 计数资料组间比较采用χ2检验或Fisher's exact test，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 铜绿假单胞菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性

琼脂稀释法药敏测定显示，59株临床分离铜绿假单胞菌对庆大霉素均耐药，对阿米卡星耐药率为88.1%（见表1）。

2.2 铜绿假单胞菌16S rRNA甲基化酶基因分布

59株临床分离铜绿假单胞菌的16S rRNA甲基化酶基因总检出率62.7%（37/59），其中armA检出率28.8%（17/59），rmtB检出率37.3%（22/59）；2株铜绿假单胞菌同时检出armA和rmtB基因；未检出其他甲基化酶基因。16S rRNA甲基化酶基因仅见于庆大霉素高耐（MIC≥128 mg/L）菌株，16S rRNA阳性株对阿米卡星的敏感率低于阴性株（2.7%比22.7%，P=0.011）（见表1），armA和rmtB阳性菌株的阿米卡星MIC50均＞128 mg/L。

表1 59株铜绿假单胞菌对庆大霉素的药敏结果及16S rRNA甲基化酶检出情况Table 1 Distribution of gentamicin MIC values and 16S rRNA methylase genes in 59 strains of extensively drug resistant Pseudomonas aeruginosa

2.3 铜绿假单胞菌临床分离株的同源性

根据ERIC-PCR的条带谱型，59株受试株可分为19个型别，其中D型最为常见（31株，52.5%）。检出armA的17株铜绿假单胞菌集中分布在D、E、和I 3个谱型，其中D型占88.2%（15/17）。检出rmtB的22株铜绿假单胞菌散布在9个谱型。

2.4 16SrRNA甲基化酶基因周边序列

2.4.1armA基因周边序列 临床分离株HSPA 26经酶切、克隆及庆大霉素平皿筛选，仅HindIII酶切产物有携带armA基因的转化子，测序获得的拼接序列长度为4 042 bp，与GenBank序列比对结果显示，铜绿假单胞菌临床分离株携带armA基因位于一含多种转座酶的DNA序列（图1），与大肠埃希菌质粒pNDM-HK（登录号HQ451074）、鲍曼不动杆菌质粒pZJ06（登录号CP001938）携带的armA阳性质粒序列一致性达99%。

图1 铜绿假单胞菌临床株armA基因周边基因结构同源质粒示意图Figure 1 Schematic depiction of the flanking sequences of armA gene in Pseudomonas aeruginosa isolate，which is homologous to the armA-positive plasmid

2.4.2rmtB基因周边序列 临床分离株HSPA 23经酶切、克隆及庆大霉素平皿筛选，也只有HindIII酶切产物有携带rmtB基因的转化子，测序获得的拼接序列长度为3 035 bp，与GenBank序列比对结果显示，铜绿假单胞菌临床分离株携带rmtB基因位于一含转座酶的序列，其上游有一blaTEM-1基因，这2个耐药基因与源自大肠埃希菌（登录号HG003695）和肺炎克雷伯菌（登录号CP003225）的质粒序列一致性高；但本研究获得的铜绿假单胞菌序列中，两耐药基因间有一铜绿假单胞菌特有的转座酶基因（图2）。

3 讨论

2003年法国和日本学者先后发现了一种由质粒介导的新的耐药机制——16S rRNA甲基化酶，甲基化酶修饰细菌核糖体16S rRNA，通过靶位改变导致细菌对多种氨基糖苷类抗生素耐药，该酶导致革兰阴性杆菌对庆大霉素等多种临床常用氨基糖苷类药物高度耐药。继而，有多个国家和地区在多种革兰阴性杆菌中检测到编码这类酶的基因，包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA和armA[4-10]，以及本研究后期发现的rmtF、rmtG和rmtH[13-15]。这些基因位于质粒或转座子上，易于传播，成为抗感染治疗的重要问题。

图2 铜绿假单胞菌临床株rmtB基因周边基因结构Figure 2 Homology analysis of the flanking sequences of rmtB gene in Pseudomonas aeruginosa isolate

16S rRNA甲基化可导致革兰阴性菌对氨基糖苷类高水平耐药[16]。自发现以来，先后在铜绿假单胞菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、奇异变形杆菌等多种细菌中检出16S rRNA甲基化酶基因[4-10，13，17-26]。铜绿假单胞菌临床株中已检出携带armA、rmtA、rmtB和rmtD等16S rRNA甲基化酶基因，不同地区基因分布差异较大：日本临床分离株中rmtA阳性率0.8%[20]；在我国，氨基糖苷类高水平耐药株中armA和rmtB阳性率分别为74.3%和14.3%[4]，亚胺培南耐药株中rmtA阳性率为5.9%[21]，多重耐药株中rmtB阳性率10%～42.4%[22-24]；越南[25]和巴西[26]亚胺培南耐药株中rmtD阳性率分别为13.5%和75%。本研究中，16S rRNA甲基化酶基因在XDR铜绿假单胞菌分离株中分布广泛，总检出率高达62.7%，均为armA和rmtB，并全部在庆大霉素高度耐药菌株中检出，这与之前上海地区报道结果基本相符。ERIC-PCR结果显示，armA基因在特定谱型中检出率高，提示携带该基因的菌株存在克隆传播，医院感染防控需关注消毒、隔离。

既往对16S rRNA甲基化酶周边结构研究显示，rmtA与转座子Tn5041相连[27]，而rmtB则被Tn3-类似结构包围[17]。armA基因位于转座子Tn1548上，并与一个可介导多重耐药的1型整合子共同存在于一个大质粒上[28-29]。基于这些周边结构分析，16S rRNA的传播被认为是由大质粒上的可移动元件介导。本研究对铜绿假单胞菌临床分离株armA和rmtB基因周边序列分析结果与之相似，armA基因周边含多种假定转座酶（putative transposase），与大肠埃希菌（pNDM-HK）、鲍曼不动杆菌（pZJ06）携带的armA阳性质粒序列一致性达99%；rmtB基因同样位于一含多种转座酶的序列，耐药基因与源自大肠埃希菌（登录号HG003695）和肺炎克雷伯菌（登录号CP003225）的质粒序列一致性高，但转座酶与源自一耐多药铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosaNCGM2.S1）的序列同源，与大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的转座酶不同。鉴于armA及rmtB周边均含转座酶，推测两基因位于质粒携带的移动元件，提示此类耐药基因可在不同菌种间水平传播。

总之，研究结果显示16S rRNA甲基化酶基因在XDR铜绿假单胞菌分离株中分布广泛，均在对庆大霉素高度耐药的菌株中检出。armA在铜绿假单胞菌中存在克隆传播，且armA及rmtB基因可能位于质粒携带的移动元件，会在不同菌种间水平传播。研究结果可为医院感染控制策略制定提供参考依据。

[1] FALAGAS ME， BLIZIOTIS IA， KASIAKOU SK， et al.Outcome of infections due to pandrug-resistant（PDR） Gramnegative bacteria [J]. BMC Infect Dis， 2005， 5（1）： 24.

[2] POULIKAKOS P， FALAGAS ME. Aminoglycoside therapy in infectious diseases[J]. Expert Opin Pharmacother， 2013， 14（12）： 1585-1597.

[3] JANA S， DEB JK. Molecular understanding of aminoglycoside action and resistance[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2006， 70（2）：140-150.

[4] BOGAERTS P， GALIMAND M， BAURAING C， et al.Emergence ofArmAandRmtBaminoglycoside resistance 16S rRNA methylases in Belgium [J]. J Antimicrob Chemother，2007， 59（3）： 459-464.

[5] BOROVINSKAYA MA， PAI RD， ZHANG W， et al. Structural basis for aminoglycoside inhibition of bacterial ribosome recycling [J]. Nat Struct Mol Biol， 2007， 14（8）： 727-732.

[6] BOUZIDI N， AOUN L， DEKHIL M， et al. Co-occurrence of aminoglycoside resistance genearmAin non-TyphiSalmonellaisolates producing CTX-M-15 in Algeria [J]. J Antimicrob Chemother， 2011， 66（9）： 2180-2181.

[7] BRIGANTE G， MIGLIAVACCA R， BRAMATI S， et al.Emergence and spread of a multidrug-resistantAcinetobacter baumanniiclone producing both the carbapenemase OXA-23 and the 16S rRNA methylaseArmA[J]. J Med Microbiol， 2012，61（Pt 5）： 653-661.

[8] CASTANHEIRA M， FRITSCHE TR， SADER HS， et al.RmtD16S RNA methylase in epidemiologically unrelated spm-1-producingPseudomonas aeruginosaisolates from Brazil [J].Antimicrob Agents Chemother， 2008， 52（4）： 1587-1588.

[9] CHEN L， CHEN ZL， LIU JH， et al. Emergence ofRmtBmethylase-producingEscherichia coliandEnterobacter cloacaeisolates from pigs in China [J]. J Antimicrob Chemother， 2007，59（5）： 880-885.

[10] ZHOU Y， YU H， GUO Q， et al. Distribution of 16S rRNA methylases among different species of Gram-negative bacilli with high-level resistance to aminoglycosides[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2010， 29（11）：1349-1353.

[11] CLSI. performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. Twenty sixth informational supplement M100-S26，2016.

[12] VERSALOVIC J， KOEUTH T， LUPSKI JR. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes[J]. Nucleic Acids Res， 1991，19（24）：6823-6831.

[13] GALIMAND M， COURVALIN P， LAMBERT T. RmtF， a new member of the aminoglycoside resistance 16S rRNA N7 G1405 methyltransferase family[J]. Antimicrob Agents Chemother，2012， 56（7）：3960-3962.

[14] O'HARA JA， MCGANN P， SNESRUD EC， et al. Novel 16S rRNA methyltransferase RmtH produced byKlebsiella pneumoniaeassociated with war-related trauma[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013， 57（5）：2413-2416.

[15] WACHINO J， ARAKAWA Y. Exogenously acquired 16S rRNA methyltransferases found in aminoglycoside-resistant pathogenic Gram-negative bacteria ： an update[J]. Drug Resist Updat，2012， 15（3）：133-148.

[16] DOI Y， ARAKAWA Y. 16S ribosomal RNA methylation：emerging resistance mechanism against aminoglycosides[J]. Clin Infect Dis， 2007， 45（1）：88-94.

[17] DOI Y， YOKOYAMA K， YAMANE K， et al. Plasmid-mediated 16S rRNA methylase inSerratia marcescensconferring highlevel resistance to aminoglycosides[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2004， 48（2）： 491-496.

[18] VAKULENKO SB， MOBASHERY S. Versatility of aminoglycosides and prospects for their future[J]. Clin Microbiol Rev， 2003， 16（3）： 430-450.

[19] WACHINO J， YAMANE K， SHIBAYAMA K， et al. Novel plasmid-mediated 16S rRNA methylase，RmtC， found in aProteus mirabilisisolate demonstrating extraordinary high-level resistance against various aminoglycosides[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2006， 50（1）： 178-184.

[20] YOKOYAMA K， DOI Y， YAMANE K， et al. Acquisition of 16S rRNA methylase gene inPseudomonas aeruginosa[J].Lancet， 2003， 362（9399）： 1888-1893.

[21] 唐慧琴，陈定强，吴爱武. 亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的耐药性与相关耐药基因[J]. 实用医学杂志，2016，32（23）：3947-3950.

[22] 糜祖煌，秦玲. 泛耐药铜绿假单胞菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究[J]. 中华医院感染学杂志，2008，18（12）：1656-1658.

[23] 汪宏良，邹义春，柯俊，等. 多药耐药铜绿假单胞菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷类修饰酶基因研究[J]. 中华医院感染学杂志，2008，18（11）：1505-1508.

[24] 崔进，赵水娣，秦湧，等. 多药耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类耐药相关基因研究[J]. 中华医院感染学杂志，2010，20（20）：3099-3101.

[25] TADA T， MIYOSHI-AKIYAMA T， KATO Y， et al. Emergence of 16S rRNA methylase-producingAcinetobacter baumanniiandPseudomonas aeruginosaisolates in hospitals in Vietnam[J].BMC Infect Dis， 2013，13：251.

[26] DOI Y， GHILARDI AC， ADAMS J， et al. High prevalence of metallo-beta-lactamase and 16S rRNA methylase coproduction among imipenem-resistantPseudomonas aeruginosaisolates in Brazil[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2007， 51（9）：3388-3390.

[27] YAMANE K， DOI Y， YOKOYAMA K， et al. Genetic environments of thermtAgene found inPseudomonas aeruginosaclinical isolates[J]. Antimicrob Agents Chemother，2004， 48（6）：2069-2074.

[28] GALIMAND M， COURVALIN P， LAMBERT T. Plasmidmediated high-level resistance to aminoglycosides inEnterobacteriaceaedue to 16S rRNA methylation[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2003， 47（8）：2565-2571.

[29] GALIMAND M， SABTCHEVA S， COURVALIN P， et al.Worldwide disseminatedarmAaminoglycoside resistance methylase gene is borne by composite transposon Tn1548[J].Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49（7）：2949-2953.