大鼠新型隐球菌脑膜炎模型的建立

林文婷， 高 睿， 滕 亮， 王一霖， 姚国泰， 陈江汉

隐球菌性脑膜炎是严重的深部真菌感染疾病，致死率高，治疗困难，复发率高，近年来发病率逐渐上升[1]，其致病机制、免疫反应及治疗手段都是目前研究的热点。建立隐球菌脑膜炎动物模型是隐球菌基础研究的重要手段之一，目前隐球菌脑膜炎动物模型主要有小鼠、大鼠、豚鼠、蚕、斑马鱼及家兔等[2-3]。小鼠对隐球菌天然易感，是目前较为成熟的动物模型，可通过气管吸入、静脉注射或腹腔注射菌液等接种途径获得，但小鼠体型小，血、脑脊液含量少，无法进行一些精细操作。建立家兔隐球菌性脑膜炎模型需使用免疫抑制剂，大鼠是否需要使用免疫抑制剂说法不一。与小鼠相比，大鼠对隐球菌抵抗力更强，目前有气管接种、静脉注射、腹腔注射及脑池注射等途径，气管接种不能导致颅内感染，静脉注射和腹腔注射不能保证颅内感染的一致性，无法控制实验变量的统一[4]。目前尚无成熟的大鼠隐球菌脑膜炎模型及相关生存率的研究。在此，我们介绍一个避免使用免疫抑制剂，可行性强、感染率高的大鼠新型隐球菌性脑膜炎模型。

1 材料与方法

1.1 材料

Sprague-Dawley雄性大鼠购于第二军医大学实验动物中心，新型隐球菌标准株H99来源于上海长征医院皮肤真菌保藏实验室，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YEPD）购于武汉谷歌生物，摇床、血球计数板、0.9% NaCl溶液、微量进样器（高鸽 /100 μL）、大鼠脑立体定位仪（美国Stoelting公司）、手术器械、75%乙醇、缝合线、1%戊巴比妥钠（美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的配制 新型隐球菌标准株H99接种于YEPD液体培养基中（酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL），置于摇床中以30 ℃、225 r/min的条件培养16～18 h，0.9% NaCl溶液洗涤2次（3 000 r/min离心5 min），用血球计数板将菌悬液浓度分别调至2×106cfu/mL、2×107cfu/mL、2×108cfu/mL。

1.2.2 脑池注射 24只体重250～300 g的雄性SD大鼠随机分成4组（A组、B组、C组、D组），1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，剃去大鼠两耳间颈背部的毛发，用耳杆将其头部固定在脑立体定位仪上，以两耳背侧下缘连线中点为中心，沿中线向切开约1.5 cm，分离皮下组织和肌肉，直至暴露出连接颅骨下缘和第一颈椎上缘的韧带，用微量进样器穿破此膜，进针约2 mm（约没过针头的斜面），保持微量进样器位置不动，缓慢抽出50 μL清亮脑脊液，再由相同位置注入50 μL配制好的菌悬液，待注入完毕后针头停留在原处约3～5 min再拔出，依次缝合肌肉及皮，全程无菌操作。

A组接种的菌负荷量为1×105cfu，B组为1×106cfu，C组为1×107cfu，D组为0.9% NaCl溶液对照组，观察接种后大鼠临床表现，在第14、21天取脑脊液做培养计数[5]，记录28 d内大鼠死亡情 况。

1.3 统计学方法

采用Graphpad 7.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，采用Log-rank检验进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床表现

A组大鼠毛发生长正常，姿势体位正常，体重增加，反应灵敏；B组大鼠毛发正常，姿势正常，体重无明显减轻，反应力稍有下降；C组大鼠毛发干枯，失去光泽，体重进行性下降，呈明显弓背向上姿势，反应迟钝；D组大鼠正常生长，毛发正常，姿势无异常，体重正常生长，反应灵敏。

2.2 脑脊液培养

第14天和第21天脑脊液培养结果如图1所示。A组菌负荷减少，从（27 000±4 858）cfu/mL降至（13 667±2 944）cfu/mL；B组菌负荷增加，从（33 000±7 682）cfu/mL升至（45 000±12 712）cfu/mL；C组菌负荷增加，从（49 500±23 856）cfu/mL上升至（72 600±15 060）cfu/mL；D组无菌落生长。

图1 第14天和第21天大鼠脑脊液培养结果Figure 1 The results on day 14 and day 21 culture for Cryptococcus neoformans with the cerebrospinal fluid of rats

2.3 生存曲线

大鼠生存率如图2所示，A组无大鼠死亡，生存率100%；B组在接种后第21天有1只大鼠死亡，28 d生存率83.33%；C组接种后第16天开始出现大鼠死亡，28 d生存率16.67%，中位生存时间23.5 d。统计学上，A组和B组生存曲线差异无统计学意义（P＞0.05），A组与C组、B组与C组生存曲线差异有统计学意义（P＜0.05）。D组为对照组，所有大鼠全部存活。

图2 大鼠28 d生存曲线Figure 2 The 28-day survival curve of rats after challenging with Cryptococcus neoformans by intracisternal injection

3 讨论

随着隐球菌的研究不断深入，其动物模型也在不断发展，根据不同的研究目的，选择不同的动物模型。隐球菌大鼠模型中，气管接种主要用于建立隐球菌肺炎模型[6]；静脉注射和腹腔注射可以感染脑或肺，但感染的程度可能不同，无法控制实验变量的统一。鞘内注射可直接造成大鼠颅内感染，不需要使用免疫抑制剂，可以保证颅内感染的一致性。

大鼠枕大池脑脊液丰富，从颈背部沿中线切开，分离组织肌肉，直至暴露连接颅骨下缘和第一颈椎上缘的韧带，在可视的情况下保证进针的深度约1～2 mm，可避免触碰深处神经组织，此方法简单可行，平均10 min可接种一只大鼠。前期研究发现，新型隐球菌原代菌株毒性最强，转平皿后生长出来的菌落毒性减弱，因此要选取原代培养皿上的菌落，增菌培养后立即接种造模，保持菌体活性，以避免造模失败。

1×105cfu新型隐球菌鞘内注射后，大鼠无明显临床症状，未导致死亡，脑脊液菌负荷量下降，这可能与大鼠自身免疫作用有关。既往研究显示1×104cfu脑池注射后菌负荷进行性下降[7-8]，由此可以推测当隐球菌菌负荷量不超过1×105cfu时，由于大鼠对新型隐球菌的免疫作用，脑脊液菌负荷逐渐下降。1×106cfu新型隐球菌鞘内注射后，大鼠出现反应略迟钝现象，无其他临床症状，菌负荷上升，28 d死亡率16.67%。该结果表明1×106cfu已经超出大鼠自身抵抗力，但病程进展相对较慢，短时间内不能导致大鼠死亡，延长观察时间可能会有更多大鼠死亡。1×107cfu新型隐球菌鞘内注射后大鼠临床症状明显，菌负荷明显上升，急性病程，感染率高，28 d死亡率达83.33%。统计学结果表明1×107cfu大鼠的生存曲线较1×105cfu和1×106cfu有显著差异，提示1×107cfu可作为大鼠新型隐球菌脑膜炎模型构建的鞘内注射菌量。

曾有报道在脑池接种新型隐球菌前使用环磷酰胺，使大鼠处于免疫抑制的状态[9]，但是免疫抑制容易造成大鼠感染其他病原菌，导致造模失败。在非免疫抑制状态下，不同菌负荷造成大鼠感染程度不同，可根据实验目的选择不同的菌负荷，1×107cfu菌悬液鞘内注射可建立较为理想的大鼠新型隐球菌脑膜炎模型。该方法简单易行，感染率高，重复性好，为隐球菌的基础研究提供良好的方法。

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