姜黄素对高尿酸血症大鼠肾组织中TGF-β1、NF-κB表达的影响

陈亚利，欧阳军，孟晶茜，刘 丁，张文吉,崔琴琴,赵瑛瑛

1)郑州大学第二附属医院肾内科 郑州 450014 2)郑州大学医药科学研究院内分泌实验室 郑州 450052

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是一种尿酸合成增加和(或)尿酸排泄减少所引起的代谢性疾病。近年来，随着人们生活水平提高及饮食结构的改变，HUA发病率逐年上升，且呈年轻化趋势，HUA可通过炎症反应、氧化应激等途径引起肾小球硬化及肾间质肾纤维化[1]。研究[2-3]表明，转录生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)高表达是导致HUA肾损害的重要环节，HUA可诱导上调TGF-β1的表达，趋化炎症细胞诱导上皮间充质转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是一种具有多向性调节作用的核转录因子，通过调控一些细胞因子、趋化因子和蛋白基因的表达，参与HUA肾损害的炎症反应、氧化应激、免疫反应及细胞增殖等过程[4-6]。姜黄素是一种从姜黄提取出来的植物多酚，具有强大的抗炎、抗氧化作用。研究[7]发现，在糖尿病肾病等慢性肾脏病的发生发展中，姜黄素可通过减轻氧化应激、炎症反应等过程发挥肾脏保护作用。但目前关于姜黄素对HUA肾脏保护作用的研究较少，本研究拟通过建立HUA大鼠模型，观察姜黄素对HUA大鼠肾脏组织中TGF-β1及NF-κB表达的影响，探讨姜黄素肾脏保护作用的可能机制。

1 对象与方法

1.1实验动物和试剂SPF级雄性SD大鼠36只，200～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证书编号：43004700032287。每笼4只，予12 h光照、12 h黑暗交替，温度(22±2)℃，相对湿度控制在50%～60%，自由饮水及进食。氧嗪酸钾、羧甲基纤维素钠和姜黄素(美国Sigma公司)，兔抗鼠TGF-β1抗体(英国Abcam公司)，兔抗鼠NF-κB 抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2HUA模型制备及处理方法大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法将大鼠分为对照组、氧嗪酸钾组、氧嗪酸钾+姜黄素(联合)组，每组12只。氧嗪酸钾组及联合组给予750 mg/kg氧嗪酸钾灌胃[溶于5 g/L羧甲基纤维素钠(CMC-Na)中]4周，制备HUA模型[8]。模型成功后，联合组给予姜黄素200 mg/kg， 1次/d灌胃，进行8周，对照组及氧嗪酸钾组给予等量的10 g/L CMC-Na混悬液灌胃，实验共进行12周。

1.3检测项目及方法实验0、4、12周称体重，12周将大鼠放入代谢笼留24 h尿量，期间自由进食，自由饮水，将收集的尿液3 000 r/min离心5 min后取上清液，用日立全自动生化仪检测24 h尿蛋白定量；采眶静脉血1.5 mL，4 500 r/min离心10 min，取血清，用日立全自动生化仪检测血清尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、胱抑素C(Cys-C)。

1.4肾脏病理学检查和肾脏组织中TGF-β1、NF-κB蛋白检测于第12周水合氯醛腹腔注射麻醉后处死大鼠，心脏取血后迅速分离双侧肾脏，置于40 g/L多聚甲醛固定液固定24 h，石蜡包埋后切片，厚度3 μm，行HE染色及Masson染色，光镜下观察肾脏组织病理变化，并行TGF-β1、NF-κB免疫组织化学染色，阳性信号为棕黄色着色，在高倍镜视野下选取10个不重叠的视野，用Image-pro-plus version 6.0图像分析软件测定TGF-β1、NF-κB在肾脏组织中的表达量，并进行半定量评分。

1.5统计学处理采用SPSS 20.0进行分析，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组大鼠BUN、Scr、Cys-C、24 h尿蛋白定量水平的差异，应用重复测量数据的方差分析比较各组大鼠不同时间点血清UA水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组大鼠一般状况比较实验期间，对照组大鼠一般状况良好，饮食正常；氧嗪酸钾组大鼠出现精神欠佳，皮毛干枯，发黄，光泽度差； 联合组大鼠经过治疗干预后，精神状态好转，毛发改善。实验期间各组大鼠均无死亡。

2.2各组大鼠生化指标比较见表1。

2.3各组大鼠不同时间点血清UA水平比较见表2。实验前，3组大鼠血清UA水平差异无统计学意义(P>0.05)，实验第4、12周，与对照组相比，氧嗪酸钾组及联合组UA水平升高(P<0.05)，氧嗪酸钾组与联合组尿酸水平差异无统计学意义。

2.4各组大鼠肾脏病理改变见图1。对照组大鼠肾小球、肾小管结构清楚，基底膜厚度均一，毛细血管腔开放良好，间质未见炎性细胞浸润、纤维组织增生；氧嗪酸钾组大鼠肾小球结构清晰，未见明显肿大，部分肾小管上皮细胞肿胀，肾小管轻度扩张，肾间质少量炎性细胞浸润，纤维组织成分明显；联合组大鼠肾小球结构清楚，无明显肿大，毛细血管腔开放良好，肾小管间质炎性细胞浸润较氧嗪酸钾组明显减轻，纤维组织成分明显减少。

2.5各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、NF-κB蛋白检测结果见表3、图2。对照组大鼠肾小球及肾小管TGF-β1、NF-κB均少量表达；氧嗪酸钾组及联合组表达量明显增加(P<0.05)，主要在肾小球及肾小管表达；与氧嗪酸钾组相比，联合组表达量减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠BUN、Scr、Cys-C、24 h尿蛋白定量水平比较(n=12)

*：与对照组比较，P<0.05；#：与氧嗪酸钾组比较，P<0.05

表2 各组大鼠不同时间点血清UA水平比较(n=12) μmol/L

F组别=202.209，F时间=348.146，F交互=13.758；P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05

表3 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、NF-κB蛋白半定量分析比较 (n=12)

FTGF-β1=51.551,FNF-κB=40.288,P均<0.001；*：与对照组比较，P<0.05；#：与氧嗪酸钾组比较，P<0.05

1：HE染色；2：Masson染色；A：对照组； B：氧嗪酸钾组；C：联合组图1 3组大鼠肾脏病理学变化(HE和Masson染色,×400)

3 讨论

传统认为，HUA主要通过尿酸盐晶体在肾脏沉积引起肾脏损伤，其机制类似痛风性关节炎；近年来多项研究[9-12]表明，无症状HUA可通过炎症反应、氧化应激及激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)等引起肾小球硬化及肾间质纤维化。本研究结果显示，与对照组相比，氧嗪酸钾组及联合组于第4周血清UA水平升高，提示单独应用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾可成功建立HUA模型。研究[6]发现，在糖尿肾病等慢性肾脏病的发生发展中，姜黄素可通过减轻氧化应激、炎症反应及调控多种细胞因子的表达，发挥肾脏保护作用。本研究结果显示：实验第12周，与对照组比较，氧嗪酸钾组的Scr、BUN及Cys-C水平均明显升高；经姜黄素干预后，联合组的Scr、BUN及Cys-C均明显下降，提示姜黄素对HUA引起的肾损伤具有保护作用。正常情况下，大部分蛋白不能通过肾小球滤过膜，尿中的蛋白量极少，当肾小球滤过膜受损时可出现蛋白尿增加[13]。本研究结果显示，12周氧嗪酸钾组的24 h尿蛋白定量较对照组明显升高，差异有统计学意义，与上述报道相符，但其确切机制有待进一步研究。

1：TGF-β1；2：NF-κB；A：对照组； B：氧嗪酸钾组；C：联合组图2 3组大鼠肾脏组织中TGF-β1、NF-κB蛋白表达(SP，×400)

姜黄素是姜黄的主要成分，属于植物多酚，具有广泛的生物活性， 如抗炎、抗氧化、抗癌和促进伤口愈合等特性[14]。TGF-β1是目前主要的致组织纤维化的细胞因子，TGF-β1高表达与肾脏损伤关系密切，不仅参与糖尿病肾病的发生发展[15-16]，在HUA肾病中也发挥重要作用[2-3]。TGF-β1在正常肾组织内较少表达，而在受损的肾小球、肾小管内表达增加。TGF-β1不仅能够抑制ECM降解，还能够诱导包括黏连蛋白在内的多种ECM成分表达并积聚在肾小球、肾间质内，引起肾小球硬化及肾间质纤维化[17-18]。Zhu等[19]的研究结果显示，姜黄素通过调控mTOR/Akt通路，下调TGF-β1表达，减缓EMT，在慢性肾脏病及肾移植中发挥肾脏保护作用。Ho等[20]研究发现，姜黄素可通过拮抗Wnt/β-catenin信号抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT，从而延缓糖尿病肾病间质纤维化的进展。本研究结果显示，氧嗪酸钾组TGF-β1表达量较其他组明显增强，其在肾小球、肾小管均强阳性表达；与氧嗪酸钾组比较，联合组TGF-β1表达明显减少，且联合组肾功能及肾间质纤维化程度较氧嗪酸钾组均明显好转，表明姜黄素可通过下调TGF-β1的表达而发挥肾脏保护作用。

普遍被认为NF-κB是许多细胞因子的关键调节因子，可以调控多种细胞因子如TNF-α、IL-6 的表达，从而在机体的炎症、免疫应答、细胞增殖、凋亡等方面发挥重要作用[3]。研究[21]表明：在糖尿病肾病大鼠模型中，姜黄素可通过下调P-300及NF-κB的表达，减轻肾间质炎症反应和肾组织纤维化。本研究结果显示，与对照组相比，氧嗪酸钾组NF-κB表达量增加，且以肾小管间质表达为主；联合组NF-κB表达明显减少，肾功能也较模型组模型改善，但UA水平无明显下降。本研究结果提示姜黄素可能通过减轻氧化应激调控NF-κB的表达，减轻肾脏炎症反应及肾组织纤维化。

近年来，姜黄素的在HUA的药理作用受到极大关注，Zhang等[22]研究发现在果糖引起的HUA大鼠模型中，姜黄素可能通过抑制JAK-STAT的激活及TGF-β1的过表达，上调肾脏NO水平，起到改善肾脏内皮功能障碍和提高尿酸转运蛋白能力，从而具有降UA及肾脏保护作用。Ao等[23]研究发现，姜黄素可通过抑制尿酸盐阴离子转运体1，促进UA排泄，从而有望成为新型的治疗痛风的药物。本研究结果显示，与氧嗪酸钾组相比，联合组UA值未见明显下降，差异无统计学意义，考虑可能与本实验周期短及样本量少有关，有待增大样本及延长实验周期进一步验证。

综上所述，单独应用氧嗪酸钾可成功建立HUA模型；HUA可上调 TGF-β1及NF-κB的表达，引起肾脏损伤；姜黄素具有抗氧化应激及炎症反应，可以通过下调TGF-β1和NF-κB的表达，发挥肾脏保护作用，为HUA的治疗提供新思路。

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