四种人子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1的定位及表达

雷冬梅，赵晨阳，郭瑞霞，雷 佳，楚天骄，林艳丽

1)郑州大学第三附属医院病理科 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院妇产科 郑州 450052

子宫内膜癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，其发生发展是多因素参与的复杂过程。探讨细胞因子在此过程中的作用对于子宫内膜癌的防治有积极的意义。胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins，IGFBP)是胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)系统的重要组成部分，包括15个家族成员，其中传统的IGFBP1～6主要通过调控IGF的半衰期发挥生物学效能。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)即IGFBP7，有别于传统的IGFBP1～6，与IGF的结合力较低，但可与胰岛素高度结合[1]。而且IGFBP-rP1可以不依赖于IGF而独立发挥生物学活性，被认为是一种典型的肿瘤生长抑制因子，在多种肿瘤中发挥抑制作用[2-5]。目前IGFBP-rP1与子宫内膜癌的关系尚未明确，本实验通过检测不同子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1的表达情况，为后续研究IGFBP-rP1在子宫内膜癌中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1主要材料人子宫内膜癌细胞系HEC-lA、Ishikawa由河南省医药科学研究院实验室保存，RL95-2、HEC-1B购自中科院细胞库，RPMI 1640培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基购自北京索莱宝科技有限公司，兔抗人IGFBP-rP1多克隆抗体购自美国Abcam公司，兔抗人GAPDH多克隆抗体购自杭州贤至生物科技有限公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自鼎国生物技术有限公司，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，TRIzol试剂购自康为世纪生物科技有限公司；逆转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒购自日本TOYOBO公司。

1.2细胞培养HEC-1A和HEC-1B细胞置于含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，Ishikawa及RL95-2细胞分别置于含体积分数10%胎牛血清的RMPI 1640、DMEM/F12培养基中，在37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养。每天观察细胞生长状况，每2～3 d进行消化传代。

1.3细胞免疫荧光法检测4种子宫内膜癌细胞中IGFBP-rP1蛋白的表达部位在6孔板中放置盖玻片，将对数生长期的Ishikawa、HEC-lA、HEC-1B细胞用胰蛋白酶消化后，接种于其上面，24 h后取出爬片。由于RL95-2细胞系爬片困难，采用滴片法接种于玻片上。均用40 g/L的多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次。Triton-X100室温通透15 min，PBS洗涤3次，山羊血清封闭30 min，滴加兔抗人IGFBP-rP1一抗(按1150稀释)，4 ℃孵育过夜。滴加对应的荧光二抗，避光孵育30 min， DAPI染核，并在荧光显微镜下观察。阴性对照用PBS代替一抗，所有实验均在相同条件下进行。

1.4荧光定量PCR检测4种子宫内膜癌细胞中IGFBP-rP1mRNA的表达收集对数生长期的4种子宫内膜癌细胞，Trizol法提取细胞总RNA。按反转录试剂盒说明将RNA反转录成cDNA，以此为模板进行荧光定量检测。IGFBP-rP1引物序列：上游5’-CAGGTGTACTTGAGCTGTGAGG-3’，下游5’-CATGTAAGGCATCAACCACTGT-3’；β-actin 引物序列：上游 5’-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3’，下游5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTC-3’。采用20 μL反应体系，SYBR®Green Realtime PCR混合物10 μL，已稀释的cDNA 2 μL，上游及下游引物各0.8 μL，DEPC水补足。预变性：95 ℃ 60 s，1个循环；PCR 反应： 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。采用 2-ΔΔCt法计算IGFBP-rP1 mRNA的表达水平。实验均重复3次。

1.5Westernblot检测4种子宫内膜癌细胞中IGFBP-rP1蛋白的表达对数生长期的子宫内膜癌细胞经胰蛋白酶消化后，提取细胞总蛋白并测定蛋白质浓度。100 g/L SDS-PAGE电泳后，200 mA 1 h湿转至PVDF膜。50 g/L脱脂奶粉液常温封闭1 h，滴加兔抗人IGFBP-rP1一抗(按1800稀释)，兔抗人GAPDH(按11 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(按110 000稀释)，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，将增强化学发光(ECL)试剂液均匀滴到膜上，曝光并显影，用Image J软件进行灰度分析。以目的蛋白条带与GAPDH 条带灰度值比值作为IGFBP-rP1蛋白的相对表达量。实验重复3 次。

1.6统计学处理采用SPSS 20.0进行分析。应用单因素方差分析和LSD-t检验比较4种子宫内膜癌细胞中IGFBP-rP1 mRNA与蛋白表达水平的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1IGFBP-rP1在4种人子宫内膜癌细胞系中的定位见图1。IGFBP-rP1在4种子宫内膜癌细胞中均有表达，免疫荧光染色显示IGFBP-rP1主要定位于子宫内膜癌细胞的胞质中。

2.2 4种人子宫内膜癌细胞中IGFBP-rP1mRNA和蛋白的表达见表1、图2。 Ishikawa、RL95-2细胞中IGFBP-rP1 mRNA及蛋白表达水平高于HEC-1A、HEC-1-B细胞(P<0.05)；HEC-1A细胞中IGFBP-rP1 mRNA和蛋白的相对表达量最低(P<0.05)。

A：Ishikawa细胞；B：HEC-1A细胞；C：HEC-1B细胞；D：RL95-2细胞;1:目的蛋白；2：DAPI；3：Merge图1 IGFBP-rP1在4种人子宫内膜癌细胞系中的表达(×400)

表1 4种子宫内膜癌细胞中IGFBP-rP1 mRNA与蛋白表达量的比较

*：各组间两两比较，P均<0.05

图2 4种子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1蛋白的表达

3 讨论

IGFBP-rP1主要在肝脏合成，在多种组织、器官如肾脏、肝脏、卵巢中均有表达[6]，其在调控细胞的增殖、分化、凋亡、血管生成等代谢过程中发挥极为重要的作用[7]。有研究[8-9]报道，不同恶性肿瘤中IGFBP-rP1的作用方式有所不同，其在多种肿瘤如肝细胞癌、胃癌等组织中表达下调，发挥肿瘤抑制因子的作用，然而在极少数肿瘤如胶质瘤中表达上调。另有研究[10]发现，结肠癌组织中IGFBP-rP1高表达，然而在8种结肠癌细胞系中，IGFBP-rP1仅表达于SW480、Caco2细胞，其他结肠癌细胞系中其表达缺失。实体肿瘤及细胞系中IGFBP-rP1表达的异质性及作用不同，提示多种信号系统参与了其调节，然而有关IGFBP-rP1的基因调控及其与细胞因子关系的研究较少。子宫内膜癌的发生主要与子宫内膜受雌激素长期刺激以及体内雌、孕激素失衡有关。本研究选取不同雌激素受体α(ERα)表达状态的4种子宫内膜癌细胞系，其中Ishikawa、RL95-2细胞ERα阳性表达，HEC-1B、HEC-1A细胞ERα阴性表达。细胞免疫荧光染色显示4种子宫内膜癌细胞系中均存在IGFBP-rP1的表达。IGFBP-rP1 mRNA及蛋白检测提示，不同子宫内膜癌细胞系中IGFBP-rP1均有表达，且在高分化Ishikawa细胞中的表达高于中分化的其他3种细胞，提示其表达可能与分化程度有关。实验结果显示，不同ER状态的子宫内膜癌细胞系中, IGFBP-rP1 的表达有所差异，IGFBP-rP1在ERα阳性细胞系Ishikawa、RL95-2中的表达相对较高，在ERα阴性细胞系HEC-1A、HEC-1B中的表达相对较低。研究[11]发现， IGFBP-rP1在多种ERα阳性的乳腺癌细胞系及部分ERα阴性乳腺癌细胞系中表达缺失，而在少数ERα阴性乳腺癌细胞系中仍有表达；这与本研究结果并不完全一致，推测可能与不同肿瘤细胞的生物学性状差异有关。ERα是一种核受体，雌激素与ERα结合后通过调节下游靶基因的转录发挥作用[12]。研究[13]发现，接近生理剂量的雌激素可能通过ER途径使滋养层细胞中IGFBP-rP1的表达上调。而在子宫内膜癌中， IGFBP-rP1的表达是否受到雌激素的调节仍待进一步研究，这也为研究IGFBP-rP1与子宫内膜癌的关系提供新的思路。

研究[14]表明PTEN是一种抑癌基因，其在子宫内膜癌组织中的突变率明显高于正常子宫内膜，其突变及缺失参与了子宫内膜癌的发生。4种子宫内膜癌细胞系中，HEC-1A为野生型PTEN细胞系，未发生PTEN基因突变，Ishikawa、RL95-2为突变型PTEN细胞系，伴有PTEN的突变或缺失。本研究结果显示，IGFBP-rP1在HEC-1A细胞中的表达低于Ishikawa、RL95-2细胞。研究[15]发现，将结肠癌细胞与成纤维细胞共培养，成纤维细胞中IGFBP-rP1的高表达与TGF-β及经典Wnt信号通路有关。有学者[16]发现皮肤黑色素瘤中IGFBP-rP1的表达与BRAFV600E基因的突变存在相关性。

综上所述，本研究结果表明IGFBP-rP1的表达可能与PTEN基因有关，而IGFBP-rP1与PTEN之间的关系需要更为深入的研究。本研究初步筛选出相对高表达与低表达的子宫内膜癌细胞系，为进一步研究IGFBP-rP1在子宫内膜癌中的作用机制提供了理论依据。

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