新基因AY358935对B16细胞小鼠体内外生长的影响

熊绍权，蔡 蕊，李亚玲，王莉娟，罗秋月，宋婷婷，丁 倩，李世杰，何成诗

1)成都中医药大学附属医院肿瘤科 成都 610075 2)成都中医药大学附属医院呼吸科 成都 610075

AY358935是本课题组利用交叉免疫学筛选获得的一个功能未知的新基因，相对分子质量为10 100，位于人类染色体11q12.3，包含2个外显子和1个内含子，由93个氨基酸组成，N末端含有一个由23个氨基酸残基组成的信号肽和一个短的跨膜片段，预测为小分子分泌蛋白[1]。前期生物信息学分析[2]发现，AY358935在癌组织中普遍表达，提示该基因可能在肿瘤发生发展中起重要作用。有关该基因的确切功能，目前国内外尚未见有文献报道。本研究首先构建了稳定转染小鼠AY358935(mAY358935)的B16细胞(B16-mAY)，观察该细胞的体外增殖活性和小鼠体内成瘤情况，并检测B16-mAY细胞培养上清对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)生长的影响，探讨其与肿瘤的可能关系，报道如下。

1 材料与方法

1.1主要试剂pCMV-Myc-mAY重组质粒由赵新宇博士友赠；兔抗人AY358935多克隆抗体由本实验室自制[2-3]。pcDNA3.1质粒、脂质体lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。MTT、DMSO购自美国Alnreseo公司。DAB显色试剂盒购自美国Vector Laboratory公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗和兔抗人β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。BamHⅠ/XhoⅠ购自TaKaRa公司。G418、胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM培养基原粉购自美国Gibco公司。明胶由迈新生物制剂有限公司提供。

1.2细胞模型B16-mAY的建立

1.2.1 AY358935真核表达质粒的构建 pCMV-Myc-mAY重组质粒的MCS位点克隆有mAY388935的完整cDNA编码区序列。以pCMV-Myc-mAY为模板进行PCR扩增，引物序列：上游5’-CGGGATC CATGGAGGTGGCTCGTA-3’，下游：5’-CCGCTCGAG TCATGCTGACCTGCCA-3’，退火温度60 ℃，循环35次。用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1空载体并连接，构建真核表达质粒pcDNA3.1-mAY，重组质粒经双酶切和DNA测序鉴定。引物合成和DNA测序由上海英杰生物技术公司完成。

1.2.2 细胞转染及筛选、鉴定 B16细胞(购自美国ATCC)用DMEM(含体积分数10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L 链霉素)于体积分数5% CO2、37 ℃孵箱中培养。将生长状态良好的细胞接种到6孔板，待细胞长至60%～70%时，用脂质体lipofectamine2000包裹pcDNA3.1-mAY进行转染，脂质体与质粒比例为2.5 μL1 μg。转染72 h后，换完全培养基并添加G418，筛选稳定转染株。传代培养2次，提取1×106个细胞的总蛋白，Western blot法检测mAY358935蛋白表达情况，蛋白表达良好者即为B16-mAY细胞，然后保种备用。G418筛选浓度为400 mg/L，维持浓度为200 mg/L。以pcDNA3.1空质粒转染细胞(B16-pcDNA3.1)和未转染细胞(B16)作对照。

1.3B16-mAY细胞体外增殖活性的观察采用MTT法检测细胞体外生长情况。将成指数期生长的B16-mAY、B16-pcDNA3.1以及B16细胞接种到96孔板培养，每孔2 000～3 000个细胞，每种细胞5个复孔，用200 μL DMEM培养基于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中培养。96孔板提前2 h用10 g/L明胶处理。从第2天开始，每天每孔加入20 μL MTT (5 g/L)孵育4 h，弃净培养基后，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度(A)，以此表示细胞增殖活性。连续测定6 d，每天测定1次，第3天换一次培养液。实验独立重复3次。以时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.4B16-mAY细胞在小鼠体内成瘤情况的观察将成指数期生长的B16-mAY和B16-pcDNA3.1细胞用胰蛋白酶消化，1 500 r/min离心3 min后弃上清，用双无DMEM重悬细胞，洗净胰蛋白酶，再次离心，细胞沉淀用双无DMEM重悬，调整细胞密度为5×107mL-1。参照文献[4-5]，选取6～8周龄的C57/BL6小鼠24只(雌雄各半，每只体重18～22 g，SPF级别，由四川大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK<川>-09-2006)，随机分为两组，每组12只，每只腹背皮下注射100 μL的B16-mAY或B16-pcDNA3.1细胞悬液。从第8天开始，用游标卡尺测量皮下肿瘤的长径和宽径，每隔1 d测量一次，直到有小鼠因肿瘤生长而出现死亡。参照文献[6-8]计算：肿瘤体积=0.52×长径×宽径2。断颈处死小鼠，取出瘤体，用中性福尔马林固定24 h，石蜡包埋、切片，HE染色，镜下观察。

1.5B16-mAY细胞培养上清对HUVEC生长的影响①将B16-mAY和B16-pcDNA3.1细胞于体积分数5% CO2、37 ℃孵箱中用DMEM培养，当细胞生长状态良好至70%～80%单层汇合时，换新鲜DMEM 10 mL培养，24 h后收集培养上清，分别命名为mAY上清和pcDNA3.1上清，4 ℃存放，2周内使用。将mAY上清用pcDNA3.1上清进行11、13稀释，分别得1/2mAY上清、1/4mAY上清。②临床采集脐带，参照文献[9-10]报道的规范方法分离HUVEC并培养5～7 d，细胞长满至80%～90%单层汇合时传代，取传2～4代的细胞用于实验[11]。将HUVEC细胞接种到96孔板，每孔1 000～2 000个，用100 μL DMEM(不含bFGF)于37 ℃、体积分数5% CO2孵箱中培养。96孔板提前2 h用10 g/L明胶处理。接种细胞第2天，换用制备好的上清(pcDNA3.1上清、1/2mAY上清、1/4mAY上清、mAY上清)继续培养，每组5个复孔，每孔加上清100 μL，48 h后分别更换相同上清100 μL。分离接种细胞第5天，MTT法测HUVEC增殖活性，方法同前。实验独立重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。3组细胞mAY358935蛋白表达水平、增殖活性的比较采用单因素方差分析；B16-pcDNA3.1和B16-mAY细胞移植瘤体积的比较采用重复测量数据的方差分析；4组HUVEC增殖活性的比较采用单因素方差分析；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1B16-mAY细胞的鉴定pcDNA3.1-mAY经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后，产物大小280 bp，与mAY358935 ORF相符，见图1，测序结果提示正确。Western blot结果见图2，B16-mAY、B16-pcDNA3.1和B16细胞中mAY358935蛋白相对表达水平分别为(90.4±9.2)%、(39.6±3.9)%和(44.3±4.2)%,3组比较，差异有统计学意义(F=5.440,P=0.043)，B16-mAY细胞中mAY358935蛋白相对表达水平最高(P<0.05)，表明稳定转染mAY358935的细胞模型成功建立。

1:pcDNA3.1-mAY;2:pcDNA3.1-mAY酶切片段;M：DNA marker图1 pcDNA3.1-mAY的酶切鉴定

1:B16-mAY细胞;2:B16-pcDNA3.1细胞;3:B16细胞图2 3组细胞mAY358935蛋白的表达

2.2B16-mAY细胞的体外增殖活性B16-mAY、B16-pcDNA3.1和B16细胞的增殖曲线见图3。B16-mAY细胞体外生长良好。尤其在第6天时，B16-mAY、B16-pcDNA3.1和B16细胞组的吸光度值分别为(0.95±0.15)、(0.75±0.05)和(0.68±0.04)，3组比较，差异有统计学意义(F=10.431,P=0.022)，B16-mAY组明显高于其他两组(P<0.05)。

图3 3组细胞的增殖曲线

2.3B16-mAY细胞在小鼠体内的成瘤情况

2.3.1 肿瘤生长情况 两组小鼠移植瘤体积见表1。B16-mAY组移植瘤体积大于B16-pcDNA3.1组。

表1 各组移植瘤体积比较 cm3

F组别=6 647.359，F时间=549.615，F交互=437.975，P<0.001

2.3.2 肿瘤组织学表现 HE染色结果见图4，B16-mAY组移植瘤组织坏死区域明显较大；坏死肿瘤组织之间，特别是中心区域，出现岛状成活的肿瘤细胞，围绕肿瘤血管呈袖套样排列。B16-pcDNA3.1移植瘤组织相对坏死区域较少，且细胞坏死区域未发现存活细胞。

A1、B1：B16-pcDNA3.1(HE，×100)；A2、B2、C2：B16-mAY(HE，×100)；C1：C2图中放大区域(HE，×400)图4 B16-pcDNA3.1和B16-mAY细胞移植瘤组织学表现

2.4mAY上清对HUVEC增殖的影响pcDNA3.1、1/4mAY、1/2mAY和mAY上清组HUVEC的增殖活性分别为(0.36±0.06)、(0.43±0.08)、(0.61±0.09)和(0.89±0.10)，4组比较，差异有统计学意义(F=7.958，P=0.035)。1/4mAY上清即可促进HUVEC增殖，1/2mAY和mAY上清促HUVEC增殖的作用更强(P<0.05)。

3 讨论

本研究利用pcDNA3.1-mAY稳定转染B16细胞，建立稳定表达AY358935的B16-mAY细胞模型。MTT法检测发现，B16-mAY细胞体外增殖活性明显高于B16-pcDNA3.1及B16细胞，提示AY358935可促进肿瘤细胞的体外生长。接着，我们将B16-mAY细胞接种到小鼠皮下观察成瘤情况，结果显示，B16-mAY接种组移植瘤的生长快于B16-pcDNA3.1接种组。进一步对肿瘤组织进行HE染色观察，结果显示，B16-pcDNA3.1组移植瘤组织坏死区域相对较小，属于中心性坏死，坏死区域中间没有发现肿瘤血管和存活细胞；而B16-mAY接种组移植瘤组织中出现较多大面积坏死，但坏死区域并非完全呈中心性，坏死区域中间可见散在的存活细胞，围绕肿瘤血管排列成袖套状。这提示AY358935可能促进了血管生长，进而有利于肿瘤细胞的存活和增殖。虽然我们多次对移植瘤组织进行CD31和CD34免疫组化染色，但显色结果不尽如人意，分析可能原因有黑色素的干扰，或者抗原性弱化，或者由于恶性黑色素瘤常以血管拟态形成等[12-13]。

为进一步探索mAY358935的促血管生长活性，本研究用不同稀释倍数的B16-mAY培养上清培养HUVEC，结果显示，稀释2倍后的B16-mAY培养上清即可促进HUVEC的生长，完全B16-mAY培养上清的作用则更加明显，这表明mAY358935基因具有促进血管内皮生长的作用。血管生成与肿瘤的发生发展密切相关，当肿瘤体积大于1 mm3时，其增长依赖新生血管供养供给[14-18]，因而抗血管治疗成为近年来肿瘤治疗的重要策略之一[19]。本研究结果显示，AY358935基因具有促进血管内皮生长的作用，有可能成为抗血管治疗的重要靶点。

综上所述，本研究结果显示，AY358935基因具有促进肿瘤生长、促进血管生长的作用，可能是一个潜在的抗肿瘤干预靶点。

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