基于氮掺杂多孔碳及PoPD电化学免疫传感器的构建

高克，孙昭，曹凯航，杨玉晓，乔秀文*，李红玲，齐誉，叶邦策

（石河子大学化学化工学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地/材料化工新疆维吾尔自治区重点实验室，新疆 石河子 832003）

血清甲胎蛋白（AFP）作为一种功能性的癌胚糖蛋白[1]，是目前唯一广泛应用于筛查和诊断原发性肝癌的肿瘤标志物[2]。在健康人血清中AFP浓度低于25 ng/mL，而在肝癌患者中会明显增加，因此，血清中AFP的检测在诊断中起着重要的作用，广泛用于肝癌患者的早期诊断[3]。免疫传感器由于其灵敏度高、特异性强的优点得到人们的广泛关注[4]。电化学免疫分析法和其它免疫分析方法[5,6]如酶联免疫吸附测定[7]和单径向免疫扩散测定法相比，因为它的便携性，低成本和高灵敏度的测量技术[8]诸多优点可以作为一种理想的检测分析方法。

多孔碳材料具有高比表面积、高孔隙率、良好的导电性、可控的孔径和表面性能在锂电池、催化剂载体等方面有很多潜在应用。氮掺杂能改变碳材料的电学性质，使多孔碳材料在很多方面的应用得到提高[9-11]。聚邻苯二胺是聚苯胺[12-13]的衍生物，它比聚苯胺所具有的氨基及亚氨基更多，可以提供更多的再生基团[14]，在实际应用中功能性更强，是一种应用性前景较为广阔的一种聚合物材料。

本研究先将NC-CS[15]滴涂在电极表面，后通过电化学聚合邻苯二胺，从而制备了基于PoPD/NC-CS构建的甲胎蛋白免疫传感器。NC-CS的使用提高了聚邻苯二胺的电化学性质，使其呈现出较好的电化学活性。且利用壳聚糖[16]将NC固定在电极表面使其不易脱落，并且可以牢固的连接聚邻苯二胺，使其电活性很好的保持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

邻苯二胺购于 Sigma，乙二胺（C2H8N2）、乙酸、葡萄糖及壳聚糖（CS）购于国药集团（中国上海），磷酸二氢钠（NaH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）购于光复科技有限公司（中国天津），甲胎蛋白（AFP）购于赛博生物（中国郑州），牛血清白蛋白购于阿法埃莎（中国天津），铁氰化钾（K3[Fe(CN)6]）、亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6]）、氯化钾（KCL）等均购于国药集团（中国上海）；试验用水为去离子水，试剂均为分析纯。

化学实验采用三电极系统。工作电极为玻碳电极，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极。

测试仪器主要采用Potentiontat/Galvanostst Model 283分析仪（Mattson，美国）、OTF-1200X开启式管式炉（合肥科晶）、TG 16G台式高速离心机（湖南凯达）、水热反应釜（上海鹏弈）、超声波清洗仪（昆山超声仪器）、PHS-3B 数字PH计（上海宏伊）、BSA224S分析天平（德国赛多利斯）、GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱（上海景洪）等。

1.2 NC-CS的制备

在38 mL去离子水中溶解16 g葡萄糖，随后滴入乙二胺2 mL并搅拌；将搅拌配置好的溶液置于高压反应釜内，180℃下水热6 h；反应结束后自然冷却至室温，将反应得到的产物离心水洗，分别利用去离子水以及无水乙醇洗涤至澄清，再将离心得到的产物烘干（80℃，过夜）后，在管式炉中活化（400℃，2 h），得到氮掺杂的多孔碳材料（NC）。

取1 mg纯化的NC超声分散到10mL含有CS（0.5%，wt）的乙酸溶液（1%，wt）中，得到 NC-CS 分散悬浮液。

1.3 免疫传感器的组装

先将金电极（GE）依次利用0.5 μm和0.05 μm的Al2O3悬浊液抛光至镜面，然后分别在无水乙醇及去离子水中超声清洗，晾干备用。将10 μL NC-CS滴在电极表面晾干；再将电极置于含0.01 mol/L邻苯二胺及0.1 mol/L硫酸的溶液中，利用电聚合法在电极表面聚合一层聚邻苯二胺，其中聚合条件为电位区间为0.3-1.3 V，扫描速率为50mV/s，扫描圈数30圈；在4℃下，电极依次在anti-AFP和BSA中浸泡12 h及2 h，得到GE/NCCS/PoPD/antiAFP电极；在不同浓度的AFP溶液中孵育30min后，存放于4℃下保存。

免疫传感器组装过程如图1所示。

图1 免疫传感器的组装过程Fig.1 The fabrication progress of immunosensor

1.4 检测方法

本实验CV测试条件为：在含有0.1 mol/L KCl测的PBS溶液（pH=7.0）中测试，扫描电位区间为-0.9--0.1 V，扫描速率为50mV/s，孵育温度为30℃。

EIS测试条件为：pH7.0含 5.0mmol/L Fe(CN)6]3-/4-PBS缓冲液，频率为0.001 Hz-100 kHz。

2 结果与讨论

2.1 免疫传感器过程中的循环伏安表征

图2中，a是在裸电极表面聚合邻苯二胺所对应的循环伏安曲线，b是在电极表面修饰一层NC-CS后，再聚合一层聚邻苯二胺所对应的循环伏安曲线。

由图2可以看到：修饰NC-CS后再聚合聚邻苯二胺的峰电流值明显高于不修饰NC-CS的峰电流。这表明NC-CS的修饰可以提高聚邻苯二胺的电活性。

图2 多孔碳修饰对比Fig.2 Comparison of modified porous carbon

图3 是不同材料修饰电极表面后在0.1 mol/L PBS缓冲液中的循环伏安曲线。

由图3可知：

（1）GE电极的循环伏安曲线中无氧化还原峰出现（图 3a）。

（2）当NC-CS/PoPD修饰在电极表面后，出现了一对氧化还原峰（图3b）。这是由于电子媒介体被成功修饰到电极上。

（3）电极在不良导体anti-AFP及BSA溶液中浸泡后，峰电流出现明显降低（图3c、3d）。这是由于其不良导电能力阻碍了电子传递，致使电流值降低。

图3 电极修饰过程的循环伏安曲线Fig.3 CV of the different modified electrodes in 0.1 mol/L PBS solution（pH=7.0）

2.2 免疫传感器组装过程中的交流阻抗表征

图4是不同修饰电极的EIS。图4显示：

（1）裸电极出现高频率区明显小半圆及低频率区直线（图 4a）。

（2）当NC-CS修饰于电极表面后，出现了更小的半圆。这表明NC-CS表现出了良好的电子传导能力，并加速电子转移。

（3）当PoPD修饰于电极表面后，电阻明显增加（图 4c）。

（4）电极在anti-AFP及 BSA溶液中孵育后，高频区半圆依次增加（图4d、4e）。这是由于anti-AFP及BSA为不良导体能够阻碍电子转移。

（5）不同修饰电极的CV曲线及EIS表明，每一层材料成功被修饰于电极表面，完成免疫传感器的组装。

图4 电极修饰过程的交流阻抗谱图Fig.4 EIS of the different modified electrodes in 5.0mmol/L Fe(CN)63-/4-（pH=7.0）

2.3 免疫传感器的扫速

通过实验分析免疫传感器的扫描速率图，探讨该免疫传感器的电化学特性。图5是不同扫描速率对免疫传感器的影响，其中从内至外的扫描速率依次为 10、20、30、50、60、80、120、150、180mV/s。由图5可以看出：当扫描速率的平方根越大时，所对应的氧化还原峰电流值也会得到相应的增大，并呈现出良好的线性关系，如内插图所示。这表明该免疫传感器在测试底液中的氧化还原反应受扩散控制。

图5 PANI/PDA/anti-AFP修饰电极的循环伏安扫速图Fig.5 CVs of the proposed electrodes at different Scan rates

3 性能测试实验

3.1 实验条件的优化

检测液的pH值对抗体、抗原活性以及电活性物质有很大的影响。测试实验考察pH 5.0-8.0范围内PBS缓冲液中免疫传感器响应电流变化（图6a），发现所制备的免疫传感器在pH 7.0的缓冲液中时所对应的响应电流值最大。故将免疫传感器的检测液pH值选定7.0。

免疫结合反应完全的程度与抗原抗体孵育时间有很大关系（图6b）。在本实验中，NC-CS/PoPD/anti-AFP/BSA制备的免疫传感器，随着孵育时间的增加相对应的峰电流相应增加，30min后，峰电流趋于稳定，表面anti-AFP和AFP的免疫反应趋于平衡。最佳孵育时间选定为30min。

孵育温度对抗原抗体的充分结合影响明显（图6c），孵育温度为30℃时，峰电流值达到最大。

综上所述，优化实验条件选定为：pH 7.0，孵育时间30min，孵育温度30℃。

图6 免疫传感器的条件优化Fig.6 The optimization of detection conditions:pH of detection solution(a),incubation time(b),and incubation temperature(c)on the peak current of CVs.above detections in 0.1 mol/L PBS containing 0.1 mol/L KCl,Scan rate:50mV/s

3.2 免疫传感器的线性范围和检测限

基于NC-CS/PoPD/anti-AFP/BSA构建的电化学免疫传感器在含0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L PBS溶液（pH=6.5）中进行CV测定，AFP浓度从外向内为0.01-80 ng/mL，结果如图7所示。由于抗原抗体发生特异性结合反应，阻碍电子传递，所对应的峰电流浓度随着抗原浓度增加而降低（图7）。可以得到此免疫传感器的线性范围为0.005-100 ng/mL，线性方程为y=8.703logCAFP+21.93，R2=0.9921，检测限为0.0006 ng/mL。

图7 不同浓度下免疫传感器的循环伏安谱图Fig.7 CVs of different concentration of AFP in PBS solution（pH=7.0）

3.3 免疫传感器的重现性、稳定性和选择性

本实验分别探讨该免疫传感器的重现性、稳定性及选择性。

先在最优条件下对相同浓度的溶液进行检测，响应电流值的相对标准偏差小于3.8%（n=5）；再制备好免疫传感器之后，对免疫传感器进行连续扫描90圈于pH为6.5的缓冲液中，与初始电流相比，峰电流仅下降2%；最后把制备的电化学免疫传感器保存在缓冲液的上方，保存条件为pH7.0、温度4℃，每隔3天对同一传感器进行测定，30天后免疫传感器的响应电流值下降了5%。上述结果（图8）表明该免疫传感器具有较好的重现性和稳定性。

免疫传感器的选择性是衡量其抗干扰能力和特异性的重要指标。本实验中，将制备好的免疫传感器放入浓度为1 ng/mL的AFP抗原溶液和含干扰物质的80 ng/mL的AFP抗原溶液中，孵育20min，采用循环伏安法检测并记录峰电流。加入溶液中的干扰物质有牛血清白蛋白（BSA）及癌胚抗原（CEA）、多巴胺（DA）。

结果（图8）表明：两者的响应电流值无明显差异，测量误差小于3.2%。说明该免疫传感器具有较好的选择性。

4 结论

（1）成功构建了基于氮掺杂多孔碳及PoPD构建的的无标记电流型AFP免疫传感器。

（2）氮掺杂多孔碳具备良好的生物相容性，提高了PoPD的电化学活性。

（3）聚邻苯二胺的氨基及亚氨基可以固载更多的anti-AFP，从而提高电化学免疫传感器的性能。

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