陕西省手足口病重症和死亡病例的流行特征及肠道病毒71型VP1区基因特征分析

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手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)，是由人肠道病毒引起的儿童常见传染病，临床以发热、手、足、口腔和臀部等部位出现皮疹为主要临床表现[1]。大多数HFMD患者预后良好，少数患者可在短期内出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等并发症，个别重症患儿可因多种原因导致死亡。人肠道病毒71 型(human enterovirus71，EV-A71)和柯萨奇病毒A 组16 型(Coxasckievirus A16，CV-A16)是HFMD的常见和主要病原。我国于2008年将 HFMD纳入丙类法定传染病报告与管理，其防控工作一直备受关注。为了解陕西省HFMD重症和死亡病例的流行特征和病原学特点，本研究对2010-2015年监测的HFMD重症和死亡病例进行了分析，为全省制定预控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1资料来源 HFMD监测资料来源于中国疾病预防控制信息系统中上报的数据。HFMD诊断标准依据《手足口病诊疗指南》(2010年版)[2]，结合临床症状及实验室检查结果做出判定。

1.2标本采集 按照《手足口病预防控制指南(2009版)》[3]要求，采集临床诊断的HFMD 患者标本。标本以肛拭子、咽拭子和粪便为主。

1.3病毒型别鉴定 标本使用Qiagen 公司的QIAamp Viral Mini RNA Extraction 试剂盒或西安天隆公司核酸提取试剂盒提取病毒RNA。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行肠道病毒的型别鉴定。检测试剂盒为江苏硕世或上海之江生产，严格按照说明书进行操作。检验仪器为ABI 7500 实时荧光定量PCR仪。

1.4病毒分离培养 取核酸检测阳性标本200 μL接种于RD 细胞和Hep2细胞，36 ℃培养7 d，连续培养2代。如果出现典型的肠道病毒特征性细胞病变效应 (CPE)， 则收获病毒培养液，冻存于-20 ℃冰箱。

1.5病毒VP1区扩增及序列测定 收获的阳性毒株提取病毒RNA，引物序列及反应条件参照相应文献[4]，阳性产物送上海生工生物有限公司进行序列测定。使用Squencher 5.0软件进行序列拼接比对，MEGA5.0软件进行序列分析并构建亲缘进化树，建树采用相邻连接方法(Neighbor-joining)。

1.6统计学方法 采用Excel 2003软件建立数据库，描述性流行病学方法分析HFMD病例资料，SuperMap、SPSS软件进行统计学分析，率的比较用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HFMD重症和死亡病例流行概况 2010-2015年，陕西省共报告HFMD病例 339 573例，年均报告发病率为149.917 1/10 万；报告死亡病例118例，年均报告死亡率0.052 09/10万；报告重症病例5 054例，年均病死率为2.32%(表1)。陕西省HFMD发病呈波动上升趋势，重症病例和死亡病例呈现一年高一年低的现象，病死率在逐年降低。

表1 2010-2015年陕西省HFMD重症和死亡病例发病情况
Tab.1 Annual incidence of severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province, 2010-2015

时间病例数发病率(1/10万)重症数死亡数重症病死率(%)201058538155．2679340319．1220113165084．8358657152．28201257766154．40341428372．59201352647140．364454591．65201470202186．53031385201．44201568770182．166469960．86

2.2时间分布 陕西省重症病例每月均有报告，发病高峰出现在5-7 月，占报告重症病例总数的64.58%。之后逐渐下降，到9-10月份又不断上升，出现一个小高峰。死亡病例发病高峰也集中在5-7 月，占死亡病例总数的69.49%(图1)。

2.3地区分布 陕西省HFMD重症病例高发地区主要为西安、渭南、咸阳和商洛市，4市重症病例占全省重症病例总数的79.28%(图2)。死亡病例相对集中在西安、渭南、咸阳市，占报告死亡病例总数的56.78%。

图1 2010-2015年陕西省HFMD重症和死亡病例月分布图Fig.1 Monthly distribution of severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province, 2010-2015

2.4人群分布 2009-2015年陕西省HFMD重症病例中，男性3158例、女性1 896例，男女性别比1.67∶1。病例中0～岁组597 例，1～岁组2 068例，2～岁组1 241例，3～岁组685例，4～岁组272例，5～岁组165例，≥10岁26例，发病以≤3岁儿童为主，占重症病例总数的90.84%，其中1岁年龄组重症病例最多占40.92%(图3)。 报告的118例死亡病例中，男性78 例，女性40 例，男女性别比1.95∶1，死亡病例也主要为≤3岁儿童，占死亡病例总数的93.22%。

2.5病原学监测 2010-2015年陕西省共检测HFMD病例标本12 953份，其中重症病例2 698例，死亡病例63例。重症病例中，检出EV-A71型阳性1791 例(66.39%)，CV-A16 型阳性169 例(6.26%)，其他肠道病毒738例(27.35%)，不同年份之间各病原构成型别有统计学差异(χ2=307.827，P<0.001)。死亡病例的病原主要以EV-A71型为主，除2例检出其它肠道病毒外，其余61例均为EV-A71型，占96.83%(图4)。重症和死亡病例的各病原构成型别差异有统计学意义(χ2=23.261，P<0. 001)。

图2 2010-2015年陕西省HFMD重症病例地区分布图Fig.2 Geographical distribution of severe HFMD cases in Shaanxi Province, 2010-2015

图3 2010-2015年陕西省HFMD重症病例年龄分布Fig.3 Age distribution of severe HFMD cases in Shaanxi Province, 2010-2015

图4 2010-2015年陕西省HFMD重症和死亡病例病原构成情况Fig.4 Pathogenic composition of severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province, 2010-2015

分析不同病原型别的重症病例年龄分布，可见不同年龄组的各病原构成型别不同，差异有统计学意义(χ2=58.536，P<0.001)。 EV-A71型在各年龄组中均检出率最高，且随着年龄的增加不断增高，差异有统计学意义(χ2=50.688 18，P<0.001)。

2.6EV-A71病毒进化分析 对引起重症和死亡病例的主要病原EV-A71进行序列测定和进化分析。按照病例的发病年份、时间和不同地区来源，选取28株重症病例和1株死亡病例的EV-A71病毒分离株进行VP1 基因序列分析。结果显示：29株EV-A71分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别94.2%～99.7%和98.0%～100%，与GenBank 中EV71原型株(BrCr) 的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.6%～82.7% 和92.3%～94.9%。与我国C4 亚型代表株(SHZH98)的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.8%～92. 6% 和96.3%～97.6%，具有高度的同源性。系统发生树上，这29株EV-A71分离株均位于EV-A71的C4 基因亚型C4a 进化分支上，属于同一个传播链(图5)。

图5 陕西省HFMD 重症和死亡病例EV-A71 分离株VP1 序列进化树Fig.5 Phylogenetic tree of VP1 region of EV-A71 strains isolated from severe and dead cases of HFMD in Shaanxi Province

3 讨 论

HFMD传染性强，流行强度大，传播快，是严重危害婴幼儿健康的传染病。陕西省2010-2015年HFMD监测系统共报告病例339 573例，年均报告发病率为149.917 1/10 万，报告死亡病例118例，年均报告死亡率0.052 09/10万，高于全国报道的0.03/10万，报告重症病例5054 例，重症病死率为2.323%，低于全国平均水平3.0%[5]。陕西省HFMD发病呈波动上升趋势，重症病例和死亡病例呈现一年高一年低的交替现象，病死率逐年降低，至2015年已降至0.86%。

2010-2015年陕西省HFMD重症和死亡病例的发病具有明显的季节性特征，发病高峰均集中在5-7 月，分别占全省重症和死亡病例总数的64.58%和69.49%，之后病例逐渐下降，到9-10月份又不断上升，出现一个小高峰。与我国大部分地区呈现春夏季和秋季的双峰流行模式[6-7]相吻合。有学者[8]认为手足口病的季节性流行特征与降水量、日照时长、温度和气压等气候因素相关。夏季湿热环境对肠道病毒存活有利，户外感染机会增多，导致病例频繁发生。

HFMD重症病例主要集中在西安、渭南、咸阳和商洛市，四市重症病例占全省重症病例总数的79.28%；死亡病例以西安、渭南、咸阳市报告较多，占死亡病例总数的56.78%。我省重症和死亡病例主要集中在关中地区，可能与关中地区人口密度大，流动人口相对较多，传播途径易于实现，导致发病机率增高有关。

陕西省 HFMD 重症病例以≤3岁儿童为主，占重症病例总数的90.84%，其中1 岁年龄组重症病例最多达40.92%，男性高于女性。死亡病例也主要为≤3岁儿童，占死亡病例总数的93.22%。可能该年龄段儿童免疫系统不完善、自身抵抗力弱，健康卫生习惯尚未养成，对病毒普遍易感；同时儿童监护人缺乏HFMD防病知识，易造成病例漏诊或病程迁延转为重症或死亡。因此，加强≤3岁儿童的监测管理，养成其健康卫生习惯，尽可能接种EV-A71疫苗，提高儿童监护人防病知识和防护意识，对预防HFMD重症和死亡病例的发生至关重要。

2009-2015年陕西省HFMD实验室确诊的重症病例中，EV-A71、CV-A16 和其他肠道病毒的构成比分别为66.39%、6.26%和27.35%，不同年份间各病原构成型别不同。不同年龄组各病原构成型别有统计学差异，EV-A71在各年龄组中检出率最高，且随着年龄的不断增加逐渐增高。死亡病例中EV-A71检出率达到 96.83%。从病原学监测结果可见，EV-A71检出率与重症和死亡病例的发生密切相关[9]，当EV-A71为某年份流行优势病原时，重症和死亡病例就高，反之则低。EV-A71作为一种嗜神经性病毒，能引起无菌性脑膜炎、脑炎、神经源性肺水肿等中枢神经系统疾病，甚至导致死亡。因此应重点关注HFMD中EV-A71病原变化趋势，当其处于较高水平时，要及时预测、预警重症和死亡病例的发生。

对引起重症和死亡病例的主要病原EV-A71进行序列测定和进化分析，进一步探索病原遗传进化特征和致病性的关系。陕西29株EV-A71分离株的核苷酸同源性为94.2%～99.7%，氨基酸同源性为98.0%～100%，与我国C4亚型代表株之间具有高度的核苷酸和氨基酸同源性；在系统发生树上形成一个基因簇，均位于EV-A71 的C4 基因亚型C4a分支上，属于同一个传播链。我国EV-A71分子流行病学研究表明：EV-A71病毒C4基因亚型的C4a分支为2004年以来我国流行的优势基因型[10]。2010-2015年陕西省流行的EV-A71病毒，与近年来全国流行的毒株具有相同的进化来源，均属于C4基因亚型C4a进化分支，病毒在本地区已存在广泛流行和传播。

参考文献:

[1] 金奇.医学分子病毒学[M]. 北京：科学出版社，2001，1-920.

[2] 中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南(2010年版)[S]. 北京：中华人民共和国卫生部，2010.

[3] 中华人民共和国卫生部.手足口病预防控制指南(2009版)[S]. 北京：中华人民共和国卫生部，2009.

[4] Zhang Y, Tan XJ, Wang HY, et al. An outbreak of hand foot and mouth disease associated with subgenotype C4 of human enterovirus 71 in Shandong, China[J]. J Clin Virol, 2009, 44(4): 262-267.

[5] 曹洋,洪志恒,金连梅,等. 2011-2012年全国手足口病疫情监测分析[J]. 疾病监测, 2013,28(12)：975-980. DOI: 10. 3784 / j. issn. 1003- 9961. 2013. 12. 006

[6] 常昭瑞,张静,孙军玲,等.中国2008-2009年手足口病报告病例流行病学特征分析[J].中华流行病学杂志，2011，32(7):676-680. DOI：10．3760/cmad．issn．0254-6450．2011．07.009

[7] 冀天骄,谭小华,刘冷,等. 广东省2008-2015年手足口病流行病学特征及病原学监测分析[J]. 病毒学报，2016，32(6)：713-720．DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003067

[8] Xing WJ, Liao QH, Viboud C, et al. Hand, foot, and mouth disease in China, 2008-12: an epidemiological study[J]. Lancet Infect Dis, 2014, 14: 308-318.

[9] 于石成,周征奇,杨芳,等．中国2008-2013年度重症手足口病的时空聚集性及其变化趋势分析[J]. 中华流行病学杂志，2014，35(3): 271-275． DOI：10．3760/ema．j．issn．0254-6450．2014．03．012

[10] Tan X, Huang X, Zhu S, et al. The persistent circulation of enterovirus 71 in People’s Republic of China: causing emerging nationwide epidemics since 2008[J]. PLoS One, 2011, 6(9): e25662.