亲缘单倍体非体外去除T细胞的造血干细胞移植和同胞全相合移植治疗儿童急性白血病的临床研究

穆艳顺 王 彬 李斯丹 朱光华 杨 骏 周 翾 王 凯 闫 岩 林 巍 秦茂权 郑胡镛

儿童异基因造血干细胞移植为目前治疗儿童白血病的一种较好的选择，同胞全相合异基因造血干细胞移植具有干细胞植入率高，急、慢性移植物抗宿主病(GVHD)发生率低的优点，仍然作为异基因造血干细胞移植首选[1,2]。鉴于中国的国情，HLA(人类白细胞抗原)配型全相合同胞供者很难获得，无关供者寻找时间长，可能贻误移植时机。单倍体相合是一种有着独特优势的造血干细胞来源的移植方式，供体易获得，有很大的依从性，可以为移植后的细胞免疫治疗提供巨大便利，逐渐成为寻找全相合供体失败后的一种选择。由于HLA单倍体的免疫学障碍，应用常规方式移植不仅排斥反应发生率高，重度GVHD发生率也显著增高。随着近年来移植技术的进步，许多降低GVHD发生率和促进植入的方法应用于临床，如清髓性预处理方案，CD34阳性造血干细胞数量、选择性去除供者T细胞和体内非去除T细胞等，都取得了较好的疗效[3-6]。首都医科大学附属北京儿童医院(我院)应用清髓性预处理联方案，进行非体外去除T淋巴细胞的亲缘单倍体相合造血干细胞移植(简称亲缘单倍体相合组)与同胞全相合造血干细胞移植(简称同胞全相合组)治疗儿童急性白血病也取得了良好疗效。

1 方法

1.1 纳入标准 ①诊断为急性白血病完全缓解，符合我院移植适应证；②年龄1～14岁；③身体一般状况较好，无重要脏器功能不全；④采用非体外去除T细胞造血干细胞移植。

1.2 排除标准 ①合并严重慢性消耗性疾病，如糖尿病及其他恶性肿瘤；②采用无关或脐血移植；③非清髓预处理。

1.3 知情同意 采用亲缘单倍体移植是根据患儿的移植配型、疾病的状态和供受者的KIR基因分型来选择供者，移植前患儿监护人签署移植同意书。

1.4 观察指标

1.4.1 主要观察指标 ①移植相关病死率(TRM)：移植后非复发原因所导致感染、移植相关并发症所导致的死亡。②复发(RR)：髓内复发，骨髓细胞形态学检查提示骨髓中原始+幼稚细胞≥20%出现新的病态造血，微小残留病灶(MRD)>10-2；髓外复发，骨髓以外的任何组织检出白血病细胞浸润。③总体生存(OS) ：从移植后第1 d至最终随访或死亡的时间。

1.4.2 次要观察指标 ①GVHD：症状分级和临床分级按Glucksberg标准[7](表1和2)。发生于移植后100 d内为急性GVHD。②巨细胞病毒(CMV) 血症：实时荧光定量 PCR 检测外周血 CMV-DNA>5× 102copies·mL-1。③确诊CMV病：同时能从特定感染部位(支气管肺泡灌洗液、脑脊液、粪便、肠道、肝脏等标本)中检测到 CMV-DNA 阳性，或免疫组化染色、原位杂交等证实CMV阳性，同时具有相应临床症状。

表1 急性移植物抗宿主病症状分级

表2 急性移植物抗宿主病临床分级

注 如果器官受损较轻，但活动能力极度低下，也应包括在Ⅳ级

1.5 儿童急性白血病造血干细胞移植的适应证

1.5.1 儿童急性白血病第1次完全缓解 ①急性白血病诱导治疗失败；②急性淋巴细胞白血病t(9;22)或BCR/ABL融合基因阳性；③急性淋巴细胞白血病t(4;11)或MLL/AF4融合基因阳性，或其他MLL重排有移植指证的急性白血病；④急性髓性白血病高危患者；⑤混合表型急性白血病；⑥转化型急性髓性白血病(t-AML)。

1.5.2 儿童急性白血病第2次完全缓解 ①急性淋巴细胞白血病存在微小残留病；②急性淋巴细胞白血病骨髓复发且第1次完全缓解期持续的时间<30个月；③急性髓性白血病第2次完全缓解。

1.5.3 儿童急性白血病第3次及以上完全缓解。

1.6 HLA配型与供者的选择标准 所有供者均选择亲缘关系供者，HLA配型根据组织相容性抗原检测HLA-A、B、C、DR位点，采用微量顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)方法。供者中各项常规检查、肝肾功能、传染病、心肺功能、肝胆脾超声等检查均提示为健康供者。根据配型相合程度、年龄、性别及健康状况选择供者。

1.7 不同预处理方案选择原则

1.7.1 同胞全相合组预处理方案 马利兰(每次0.8～1.2 mg·kg-1，每日4次静脉滴注4 d，-9、-8、-7和-6)+环磷酰胺(50 mg·kg-1·d-1，静脉滴注4 d，-5、-4、-3和-2)。

1.7.2 亲缘单倍体相合组预处理方案 ①方案1：氟达拉滨(25 mg·m-2·d-1，静脉滴注5d，-14、-13、-12、-11和-10)+马利兰(每次0.8～1.2 mg·kg-1，每日4次，静脉滴注4 d，-9、-8、-7和-6)+环磷酰胺(50 mg·kg-1·d-1，静脉滴注4 d，-5、-4、-3和-2)+ATG(2.5 mg·kg-1·d-1，静脉滴注5 d，-6、-5、-4、-3、和-2)；②方案2：阿糖胞苷(4 g·m-2·d-1，静脉滴注2 d，-10和-9)+马利兰(每次0.8～1.2 mg·kg-1，每日4次静脉滴注3 d，-8、-7和-6) +环磷酰胺(1.8 g·m-2·d-1，静脉滴注2 d，-5和-4)+司莫司丁(250 mg·m-2·d-1，口服，-3 d)+ATG 2.5 mg·kg-1·d-1，静脉滴注4 d，-5、-4、-3、和-2)。

1.8 供者造血干细胞的动员、采集及移植 采用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对供者进行造血干细胞动员，剂量为5～10 μg·kg-1·d-1，于动员后第4 d采集供者骨髓造血干细胞，第5 d使用COBE Spectra血细胞分离机采集外周血液细胞，应用流式细胞仪对造血干细胞进行分析，若单个核细胞数<8.0×108·kg-1、CD34+细胞数<6.0×106·kg-1，次日补充采集外周血造血干细胞，采集后于当天输给受者，回输过程中给予患儿心电监护，注意回输过程中患儿生命体征变化。

1.9 植入证据监测及植入标准 采用短串联重复序列聚合酶链反应技术(STR-PCR)或免疫荧光原位杂交法(FISH)检测植入情况。供受者性别不同时采用FISH检测性染色体的嵌合比例，供受者性别相同时使用STR-PCR检测患者外周血，并定期复查以监测和证实造血重建。定期检测ABO血型及其抗体效价，了解有无血型转换。移植后定期进行血常规、骨髓形态学、细胞遗传学和分子生物学(BCR/ABL融合基因等)检查，判定疾病状态。植入标准连续3 d中性粒细胞≥0.5×109·L-1为达到临床WBC植入，不用输PLT的情况下，连续7 d PLT≥20×109·L-1为PLT植入。

1.10 支持治疗与并发症的防治 移植的患儿移植前全面体检，清除口腔、耳鼻喉、肛门及呼吸道感染灶，移植期间入住无菌层流病房，施行全环境保护,，予无菌饮食、高糖、脂肪乳、复方氨基酸注射液等支持治疗至能正常饮食。口服伏立康唑预防真菌感染，复方新诺明预防卡氏肺囊虫感染，应用前列腺素、低分子肝素钙注射液预防静脉阻塞综合征。应用阿昔洛韦10 mg·kg-1每12 h 1次静脉滴注(从预移植的第+0d至WBC稳定植入)预防疱疹病毒感染。移植期间用PCR法每周至少检测2次血清CMV-DNA，如CMV-DNA阳性且伴有临床症状的患儿给予更昔洛韦5 mg·kg-1每12 h 1次，或膦甲酸钠30 mg·kg-1每8 h 1次，并给予丙种球蛋白等加强支持治疗。移植期间出现发热，积极寻找病原学证据，开始经验性治疗，感染明确后根据病原学结果调整抗生素用药。间断输注辐照PLT和RBC，在移植后+5 d时予皮下注射重组G-CSF至WBC稳定植入。PLT<20×109·L-1时输注辐照PLT悬液，Hb<80 g·L-1时输注辐照RBC。

2 结果

2.1 一般情况 2007年6月至2015年5月我院符合本文亲缘单倍体相合组和同胞全相合组纳入和排除标准的连续样本分别为23例和21例。亲缘单倍体相合组男15例，女8例，中位年龄为(7.8±3.5)岁，急性淋巴细胞白血病14例，急性髓性白血病9例；同胞全相合组男9例，女12例，中位年龄为(7.9±3.5)岁，急性淋巴细胞白血病8例，急性髓性白血病13例。两组性别(χ2=2.21,P=0.14)、年龄(t=0.28，P=0.78)和疾病构成(χ2=2.28，P=0.13)差异均无统计学意义。同胞全相合组按既定方案治疗，亲缘单倍体相合组中18例采用了方案1，5例采用方案2治疗。

2.2 造血恢复情况 亲缘单倍体相合组与同胞全相合组患儿WBC植入平均时间分别为(13.1±2.3)和(12.5±1.4)d, (t=1.02，P>0.05)，PLT植入时间分别为(19.4±8.0)和(22.9±7.7)d,(t=1.46，P>0.05)。+30 d行植入证据检测均获得植入。

2.3 主要观察指标 ①TRM：亲缘单倍体相合组2/23例(8.7%),同胞全相合组2/21例(9.5%)，χ2=0.02，P>0.05；②RR: 亲缘单倍体相合组4/23例(17.4%), 同胞全相合组4/21例(19.0%)，χ2=0.02，P>0.05。③OS：亲缘单倍体相合组中位随访时间(49.6±30.3)月，移植后OS 69.5%(16/23),7例死亡病例中，3例急性淋巴细胞白血病和1例急性非淋巴细胞白血病复发，2例移植相关死亡，1例死于重症肺炎相关的多脏器功能衰竭。同胞全相合组，中位随访时间(32.5±31.6)月，移植后OS 71.4% (15/21),6例死亡病例中，1例急性淋巴细胞白血病和3例急性非淋巴细胞白血病复发，2例移植相关死亡。图1显示两组OS差异无统计学意义(χ2=0.003，P>0.05)。

图1 两组OS统计

2.4 次要观察指标 急性GVHD症状分级中，亲缘单倍体相合组与同胞全相合组急性GVHD(0～4+)皮肤斑丘疹症状分别为12和5例, 胆红素>34 μmol·L-1分别为7和4例,肠道腹泻量>500 mL·d-1分别为7例和2例。亲缘单倍体相合组与同胞全相合组的GVHO临床分级分别为15和5例，亲缘单倍体相合组与同胞全相合组急性GVHD(Ⅰ～Ⅳ)65.2%(15/23)和23.8%(5/21)，χ2=7.59，P<0.05。

3 讨论

异基因造血干细胞移植是可能治愈白血病的治疗措施，但由于受HLA不合的免疫学障碍，多年来异基因造血干细胞移植多在同胞全相合供受者之间进行，在亲属间找到HLA全相合同胞供者的机会仅为25%[8-10]，几乎所有需要移植治疗的患者均可在自己的亲属中及时找到HLA单倍体供者，亲缘单倍体造血干细胞移植，成为国内外学者一直研究的热点，系统地对非体外去T细胞单倍体与全相合移植后免疫功能重建在成人移植中较好的疗效越来越受到国际关注。近年来单倍体移植取得的效果已经与无关供者的移植效果相当，生存质量相比同胞全合移植也无明显差异，国外报道急性淋巴细胞白血病异基因造血干细胞移植后5年LFS 为58.6%，急性非淋巴细胞白血病患儿5年LFS 为(47±5)%，疗效满意[11]。本研究通过对亲缘单倍体非体外去除T细胞的造血干细胞移植的23例白血病患儿及同胞全相合治疗的21例白血病患儿的临床资料对比分析显示，所有患儿均获得了较快速的造血重建，两组中性粒细胞及PLT重建的中位时间相近。移植后1个月，经性染色体FISH方法检测、ABO血型鉴定及STR-PCR检测证实两种移植类型均可获得造血干细胞成功植入。生存分析显示，亲缘单倍体组总体生存率分别为69.5%，同胞全相合组总体生存率为71.4%,差异无统计学意义，提示亲缘单倍体造血干细胞组未出现植入延迟或植入不良现象。同胞全相合造血干细胞移植采用非体外去除T淋巴细胞外周血作为造血干细胞来源进行移植，亲缘单倍体移植采用非体外去除T淋巴细胞外周血和骨髓作为造血干细胞来源进行移植，供者耐受性好，易于接受，而且在移植时可应用血液分离机对经G-CSF 动员的供者造血干细胞 多次单采，满足移植所需的足够数量的CD34+细胞，G-CSF 主要作用于髓系造血细胞的增殖、分化和活化，可使干细胞增加，且自我更新、复制能力增强。G-CSF 可有效刺激骨髓粒细胞系增殖，促进骨髓造血功能重建。另外，G-CSF可趋化供者CD4+T 细胞产生Th-2 型细胞因子应答，可减少IL-2 和INF-2 的分泌，从而减弱 GVHD 的严重度，而且经G-CSF 动员的骨髓中间充质干细胞具有免疫调节活性有利于降低GVHD 发生率。本文移植的23例亲缘单倍体白血病患儿及同胞全相合治疗的21例白血病患儿均减少了重型VHD的发生率。选择的清髓性非体外去除T淋巴细胞，有利于患儿移植后免疫功能重建并保留移植物抗白血病作用，故移植后感染相关的病死率较低，且无导致白血病复发率的增加。

虽然急性GVHD发生率亲缘单倍体组高于同胞全相合组，差异有统计学意义，但两组重度急性GVHD发生率低。本研究亲缘单倍体移植与同胞全相合移植在植入、复发率等方面差异无统计学意义。

总之，亲缘单倍体移植采用非体外去除T细胞造血干细胞移植治疗儿童急性白血病可以取得与同胞全相合造血干细胞移植相似的疗效。在缺乏HLA全相合供者时，亲缘单倍体非体外去除T细胞的造血干细胞移植是治疗儿童白血病的一种安全、有效的方法。

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