长链非编码RNA UCA1靶向miR-582-5p对膀胱癌UM-UC-3细胞生存和运动能力的调节作用及机制研究①

王 哲 张 敬 陈怀安 张 潮 刘 硕 苗文隆

(河北北方学院附属第一医院泌尿外科,张家口 075000)

膀胱癌是临床常见恶性肿瘤之一，因其具有高转移率及复发率的特点而备受关注[1,2]。但膀胱癌发病机制尚不明确，导致目前仍无治疗药物能明显影响其预后[3]。因此，探究膀胱癌发病机制是寻找治疗膀胱癌新药及新方法的关键。已有研究表明长链非编码RNA UCA1在膀胱癌中呈高表达状态，并且能够促进膀胱癌细胞的侵袭迁移，其机制与调控其下游microRNAs(miRNAs)的表达有关[4-6]。miR-582-5p 是一类抑癌基因，上调miR-582-5p表达可明显抑制肝癌、结肠癌及前列腺癌等癌细胞增殖[7-9]。 也有研究表明，miR-582-5p低表达也与膀胱癌的发展密切相关[10]。并且生物信息预测表明UCA1可能与miR-582-5p之间存在靶向关系。但UCA1能否通过靶向调控miR-582-5p的表达影响膀胱癌的增殖和迁移能力还未见报道。因此本文将以膀胱癌UM-UC-3为对象，探讨UCA1对膀胱癌细胞生存及运动能力的作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂及细胞 MEM细胞培养液、胎牛血清、胰酶和转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司;Matrigel购自美国BD公司；TRIzol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自美国ThermoFisher公司；Ki67、cleaved caspase-3和VEGF一抗购自美国Millipore公司；HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司；人膀胱癌细胞UM-UC-3购自美国ATCC，货号为CRL-1749TM；UCA1 shRNA(sh-UCA1)由上海生工生物公司设计合成，miR-582-5p inhibitor购自美国Invitrogen公司。

1.1.2仪器 ELX808酶标仪购自美国Bio-Tek公司。BD LSRFortessaTM流式细胞仪购自美国Biosciences公司。PCR仪、电泳仪及半干转膜仪均购自美国伯乐公司。Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人膀胱癌细胞用含10% 胎牛血清的MEM培养液于37℃ 5% CO2的培养箱中培养，隔天换液。细胞融合率达到85%时进行传代培养。

1.2.2细胞转染 将细胞接种于6孔板中。培养24 h后根据转染试剂盒说明书用Lipofectamine 2000分别或同时转染sh-UCA1和miR-582-5p inhibitor，48 h后进行相应检测。

1.2.3CCK8检测细胞活性 将UM-UC-3细胞传代培养于96孔板中，培养24 h后将细胞随机分为sh-Ctrl组、sh-UCA1组、sh-UCA1+miR-582 mock组和sh-UCA1+miR-582 inhib组，对细胞进行相应转染后，根据试剂盒说明书每孔加入10 μl CCK8试剂并于培养箱中继续孵育2 h，用酶标仪检测各组吸光度，计算细胞生长速度(增殖倍数=细胞吸光度/0 h 细胞吸光度)。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 细胞转染后48 h，用胰酶收集细胞，将细胞以1 000 r/min转速离心4 min，用缓冲液清洗3次后重悬沉淀，使细胞密度为3×106个/ml。加入FITC-Annexin V和PI溶液，避光孵育15 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5划痕实验 实验前用Maker笔于培养板背面划平行的5条直线，灭菌后备用。将细胞传代培养于12孔板中，用sh-UCA1和miR-582-5p inhibitor转染后，用10 μl枪头垂直于培养板背面直线划痕，用预冷的PBS洗涤3次后，加入无血清培养液进行培养，于0 h、24 h进行拍照记录，并计算划痕愈合率[划痕闭合率 =(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度]×100%。

1.2.6侵袭实验 将膀胱癌细胞以无血清培养液培养24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代接种于用Matrigel预处理的Transwell小室中，细胞密度为3×105个/ml。小室上层加入无血清培养液培养细胞，下层则加入含血清的正常培养液。48 h后用无菌棉签擦去小室上层细胞，下层细胞HE染色后计数统计。

1.2.7荧光素酶报告实验 首先通过生物信息预测miR-582-5p在UCA1上的结合位点并用PCR对UCA1上miR-582-5p的结合位点进行扩增。随后将扩增片段插入到pMIR-REPORT载体，构建UCA1野生型质粒。用基因突变技术将部分核苷酸突变，构建UCA1变型质粒。用UCA1野生型质粒、UCA1变型质粒和miR-582 mimic转染细胞后，用荧光素酶检测试剂盒进行检测，最后检测各组荧光素酶活性。

1.2.8qRT-PCR 用TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA。根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA，用PCR仪对cDNA进行扩增后用荧光定量试剂盒对进行定量分析。以β-actin为内参。反应条件为：95℃ 反应10 s、5 s，总共40个循环，最后60℃反应30 s，70℃反应30 s。实验所用的引物序列如下：UCA1 上游引物：5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游引物：5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；miR-582-5p上游引物：5′-GCACACATTGAAGAGG-ACAGAC-3′，下游引物：5′-TATTGAAGGGGGTT-CTGGTG-3′，β-actin 上游引物：5′-GGCACCACCATGTACCCTG-3′，下游引物：5′-CACGGAGTACTTGC-GCT CAG-3′。

1.2.9Western blot 用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，10% SDS-PAGE分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用5%脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗(Ki67,1∶1 000;cleaved caspase-3,1∶1 000;VEGF,1∶1 000)于4℃封闭过夜，第2天加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加ECL曝光显影。

2 结果

2.1沉默UCA1对膀胱癌细胞miR-582-5p表达的影响 实验结果表明，sh-UCA1转染细胞后，sh-UCA1组UM-UC-3细胞UCA1表达水平较sh-Ctrl组比较明显降低，表明转染成功(P<0.05，图1)；与sh-Ctrl组比较，sh-UCA1组和sh-UCA1+miR-mock组miR-582-5p表达水平明显升高(P<0.05，图1)；与sh-UCA1+miR-mock组比较，sh-UCA1+miR-inhib组细胞miR-582-5p表达水平明显降低(P<0.05，图1)。

2.2UCA1与miR-582-5p的靶向关系 生物信息预测结果表明，UCA1上存在miR-582-5p的结合位点。因此，本研究采用荧光素酶报告实验进一步确定UCA1和miR-582-5p的靶向关系。实验结果表明，miR-582 mimic可显著降低UCA1野生型质粒荧光素酶的活性(P<0.05，图2)；结合位点突变后，miR-582 mimic对UCA1质粒荧光素酶活性的调控关系消失，表明UCA1上存在miR-582-5p的结合位点。

2.3沉默UCA1对膀胱癌细胞生存能力的影响 实验结果表明，与sh-Ctrl组比较，细胞转染后5 d，sh-UCA1组和sh-UCA1+miR-mock组膀胱癌细胞生长速度明显降低(P<0.05，图3)；sh-UCA1+miR-inhib组细胞生长速度与sh-UCA1+miR-mock组比较显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图1 沉默UCA1对膀胱癌细胞miR-582-5p表达的影响Fig.1 Effect of silencing UCA1 on expression of miR-582-5p in bladder cancer cellsNote:Cells were transferred with sh-UCA1 and miR-582-5p inhibitor.mRNA levels of UCA1 and miR-582-5p were measured by RT-PCR.n=6,β-actin was used as loading control.*.P<0.05 versus sh-Ctrl group;#.P<0.05 versus sh-UCA1+miR-mock group.

同时，sh-UCA1组和sh-UCA1+miR-mock组细胞增殖标记蛋白Ki67表达水平与sh-Ctrl组比较明显降低(P<0.05，图4)；sh-UCA1+miR-inhib组细胞Ki67的表达明显升高，与sh-UCA1+miR-mock组比较差异有统计学意义(P<0.05，图4)；此外，sh-UCA1还能显著诱导膀胱癌细胞凋亡，促进凋亡标记蛋白cleaved caspase-3表达(P<0.05，图4、5)； miR-582-5p inhibitor能明显减弱sh-UCA1对膀胱癌细胞凋亡和cleaved caspase-3表达的促进作用(P<0.05，图4、5)。

2.4沉默UCA1对膀胱癌细胞运动能力的影响为了进一步探究UCA1通过靶向miR-582-5p对UM-UC-3细胞运动能力的影响，我们用Transwell实验和划痕实验检测sh-UCA1和miR-582-5p inhibitor转染后细胞的侵袭及迁移能力。Transwell实验结果表明，与sh-Ctrl组比较，sh-UCA1组和sh-UCA1+miR-mock组细胞侵袭数明显减少(P<0.05，图6)；与sh-UCA1+miR-mock组比较，sh-UCA1+miR-inhib组细胞侵袭数目明显增多(P<0.05，图6)；同时，细胞转染48 h后，sh-UCA1组和sh-UCA1+miR-mock组划痕闭合程度明显低于sh-Ctrl组(P<0.05， 图7)，sh-UCA1+miR-inhib组划痕闭合程度较sh-UCA1+miR-mock组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，图7)。此外，sh-UCA1还能显著抑制VEGF的表达(P<0.05，图4)；下调miR-582-5p表达则能明显减弱sh-UCA1对VEGF表达的抑制作用(P<0.05，图4)。

图2 UCA1与miR-582-5p的靶向关系Fig.2 Relationship of UCA1 and miR-582-5pNote:Luciferase reporter assay was performed for targeted-relationship of UCA1 and miR-582-5p.*.P<0.05 versus miR-582 mock group;#.P<0.05 versus UCA1 wt group.

图3 沉默UCA1对膀胱癌细胞生长的影响Fig.3 Effect of silencing UCA1 on growth of bladder cancer cellsNote:Cell viability was measured by CCK8 assay after cells were transferred with sh-UCA1 and miR-582-5p inhibitor.*.P<0.05 versus sh-Ctrl group;#.P<0.05 versus sh-UCA1+miR-mock group.

图4 沉默UCA1对膀胱癌细胞增殖、凋亡及侵袭迁移相关蛋白表达的影响Fig.4 Effects of silencing UCA1 on expression levels of proliferation-,apoptosis-and migration-related proteinsNote:Western blot was performed for protein levels of Ki67，cleaved caspase-3 and VEGF.GAPDH was used as loading control.*.P<0.05 versus sh-Ctrl group;#.P<0.05 versus sh-UCA1+miR-mock group.

图5 沉默UCA1对膀胱癌细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of UCA1 silencing on apoptosis of bladder caner cellsNote:Apoptosis was determined by flow cytometry.*.P<0.05 versus sh-Ctrl group;#.P<0.05 versus sh-UCA1+miR-mock group.

图1 沉默UCA1对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。

图7 沉默UCA1对膀胱癌细胞迁移能力的影响Fig.7 Effect of silencing UCA1 on migration ability of bladder cancer cellsNote:Wound healing assay was performed for migration ability.*.P<0.05 versus sh-Ctrl group;#.P<0.05 versus sh-UCA1+miR-mock group.

3 讨论

大量研究表明，长链非编码RNA在癌症的发展和转移过程中发挥重要作用[11,12]。长链非编码RNA UCA1是一类癌症诱导基因，其在多类癌症中均呈高表达状态，如乳腺癌、结肠癌、胃癌和肝癌等[6,12-15]。其在多类膀胱癌细胞系中表达显著升高，促进膀胱癌细胞增殖和迁移[16,17]。本研究发现UCA1在膀胱癌细胞UM-UC-3中呈高表达状态，且与癌症的发生发展有关。

研究表明，非编码RNA发挥生物学功能与抑制或上调下游靶标miRNA的表达密切相关[18-20]。UCA1可通过调控多种miRNA的表达影响癌症的发展。但UCA1是否能通过靶向调控抑癌基因miR-582-5p的表达影响膀胱癌的恶性进展未见报道。本研究发现miR-582-5p在膀胱癌细胞中表达明显降低，这也与之前的报道一致[10]。沉默UCA1能显著上调膀胱癌细胞miR-582-5p的表达。用miR-582-5p inhibitor抑制miR-582-5p表达后，sh-UCA1对miR-582-5p表达的促进作用明显减弱，提示UCA1和miR-582-5p之间可能存在靶向调控关系。生物信息预测结果表明，UCA1上存在miR-582-5p的结合位点，荧光素酶报告实验发现，miR-582-5p过表达可明显减弱UCA1野生质粒的荧光素酶活性，进一步表明miR-582-5p可与UCA1结合，UCA1与miR-582-5p之间存在靶向调控关系。

癌细胞无限增殖和细胞凋亡抑制是癌症发生发展的重要机制。已有研究表明UCA1能明显促进膀胱癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡[21]。本文研究发现，下调UCA1表达能显著抑制膀胱癌细胞增殖，还可降低细胞增殖标记蛋白Ki67的蛋白表达水平，而通过抑制miR-582-5p表达可部分恢复UCA1沉默引起的膀胱癌细胞的增殖受抑，说明UCA1促进膀胱癌细胞增殖与其抑制miR-582-5p表达有关。此外，沉默UCA1还能诱导膀胱细胞凋亡，促进cleaved caspase-3表达，miR-582-5p inhibitor可明显减弱sh-UCA1对膀胱癌细胞凋亡的作用，提示UCA1调控膀胱癌细胞凋亡与其靶向调控miR-582-5p表达有关。

癌细胞转移是导致癌症恶化和癌症患者死亡的主要原因[22,23]。抑制癌细胞转移能明显延长癌症患者的生存时间，降低癌症术后复发率[24,25]。UCA1过表达能促进癌细胞转移[26,27]，可被作为恶性肿瘤转移和不良预后的指标[28]。本文研究发现，沉默UCA1表达能明显降低膀胱癌细胞的侵袭及迁移能力，并能抑制VEGF的表达。VEGF是血管新生重要调控分子，其可通过促进细胞外基质降解促进细胞的迁移，促进VEGF表达可促进膀胱癌细胞迁移[29]。同时，抑制miR-582-5p表达能明显减弱sh-UCA1对膀胱癌细胞侵袭、迁移的抑制作用，提示UCA1促进膀胱癌细胞转移与其下调 miR-582-5p的表达有关。

综上所述，沉默UCA1能明显抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移，同时还能诱导膀胱癌细胞凋亡，减缓膀胱癌的恶性进展。抑制miR-582-5p表达能明显减弱sh-UCA1的抑癌作用，表明UCA1可通过靶向miR-582-5p增强膀胱癌细胞的生存及运动能力。本研究进一步阐明了UCA1促进膀胱癌发展的机制，可能为膀胱癌的治疗提供了又一新的靶标。

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