上调GDF-15表达对H2O2诱导的H9C2心肌细胞生物学特性及PI3K/AKT信号通路的影响①

王 军 张松林 和旭梅 何 璐 范粉灵

(西安交通大学第一附属医院结构性心脏病科，西安 710061)

心血管疾病是由多种信号途径调控的病理过程，目前已发现多个经典的心血管疾病相关的风险因子，其中氧化应激对其发生起到了重要的调控作用[1,2]。生长分化因子-15(Growth differentiation factor-15，GDF-15)是TGF-β家族中的一员，在炎症、外伤、心脑血管疾病、肿瘤等应激状态下可大量表达[3-5]。有研究显示，GDF-15在缺血/再灌注模型心肌中有强烈表达，心肌细胞在缺血/再灌注损伤中也可检测到GDF-15表达水平的升高[6,7]，因此研究者推测心脏中GDF-15的表达可能是避免缺血/再灌注损伤的新型防御机制；GDF-15基因敲除可明显增加小鼠的心肌肥厚，并伴随舒张和收缩功能的恶化[8]。也有研究发现，GDF-15在缺血损伤的心肌中表达强烈，并可诱导心肌细胞凋亡[9,10]。以上的研究说明，GDF-15基因可能是一个新的心脏保护因子。但关于GDF-15对心肌细胞生物学特性的影响及机制尚未清楚。因此，本研究通过制备H2O2诱导损伤H9C2心肌细胞模型，检测细胞的增殖及凋亡情况及机制，为心血管疾病的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 大鼠心肌细胞H9C2购自上海博谷生物细胞库；LipofectamineTM2000转染试剂盒、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司；增强型ECL化学发光检测试剂盒、CCK8试剂盒、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)试剂盒、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫/碘化丙锭(PI)细胞凋亡试剂盒、DCFH-DA探针均购自中国碧云天试剂公司；GDF-15、Ki67、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(Phosphorylated Serine/threonine kinase,p-AKT)均购自美国SANTA CRUZ；酶标仪购自美国Molecular Devices；实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 H9C2心肌细胞用DMEM培养基(含10%胎牛血清)，于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d传代1次。

1.2.2H2O2对H9C2心肌细胞增殖的影响 将H9C2心肌细胞1 000个/孔接种于96孔板中，培养24 h后，0、25、50、100、200、400 μmol/L的H2O2作用于细胞24 h，每孔中加入CCK8试剂10 μl，置于培养箱继续孵育2 h，收集细胞。利用空白对照孔调零，酶标仪测定570nm的吸光度A，实验重复3次。细胞增殖率=(实验组细胞A/对照组细胞A)×100%。

1.2.3分组及转染 实验分为4组，即Control组(细胞不经特殊处理)、NC组(细胞转染不具有任何干扰作用的pcDNA3.1载体)、H2O2组(加入H2O2200 μmol/L)、GDF-15+H2O2组(细胞中转染pcDNA3.1-GDF-15，然后加入终浓度为200 μmol/L的H2O2)。根据LipofectamineTM2000脂质体介导法进行转染。24 h后对各组细胞进行检测。

1.2.4各组细胞GDF-15的表达检测 采用RT-PCR及Western blot检测GDF-15的表达。RT-PCR基本步骤如下：收集转染后培养24 h的细胞，利用Trizol提取细胞中的总RNA并进行逆转录，以GAPDH作为内参基因，用SYBR Green qPCR试剂盒对GAPDH和GDF-15进行荧光定量PCR扩增。GAPDH和GDF-15的引物序列如下：GDF-15 F：5′-CATTGCCTGAGCAGCGACG-3′，R：5′-GGTAGGCTTCGGGGAGACC-3′。GAPDH F：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，R：5′-GAAGATGGTGATGGGATT-TC-3′。PCR反应条件及反应体系按照试剂盒的说明进行。实验重复3次，取Ct均值，通过2-ΔΔCt法进行统计。Western blot简要步骤如下：提取各组细胞中的蛋白，BCA试剂盒对蛋白进行定量，取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电转膜1.5 h至硝基纤维素膜，37℃、5%的脱脂奶粉封闭1 h，4℃孵育GDF-15、GAPDH(皆按照1∶1 000稀释)一抗过夜，次日加入二抗，37℃孵育2 h。增强型化学法(ECL)显影，Quantity one软件对蛋白灰度值进行分析。

1.2.5各组细胞活力检测 按照1.2.3分组处理细胞，24 h后收集细胞，每孔中加入CCK8试剂10 μl，培养箱内孵育2 h，酶标仪于570 nm处测定吸光值(A)。每组设置6个复孔，实验重复3次。

1.2.6各组细胞凋亡率检测 收集按照1.2.3处理后的细胞，采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。预冷的PBS洗涤细胞，再加入300 μl结合缓冲液悬浮细胞，取100 μl细胞悬液至流式管中，加入Annexin V-FITC及PI 各5 μl，混匀后室温避光孵育15 min，反应管中再加入400 μl的PBS。1 h内上流式细胞仪，检测细胞的凋亡情况。

1.2.7各组细胞活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)检测 收集按照1.2.3处理后的细胞，继续培养24 h，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞，再加入含有20 μmol/L的2′,7′-二氯二氢荧光素黄二乙酸酯(DCFH-DA)的磷酸盐缓冲液于37℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，加入不含胎牛血清的培养液洗涤细胞以去掉未反应的DCFH-DA，重悬细胞，流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度(激发波长为488 nm和发射波长为525 nm)。以荧光强度反映细胞内的ROS水平。实验重复3次。

1.2.8各组细胞Ki67、Bcl-2、Bax、PI3K、p-AKT蛋白表达检测 参照1.2.4方法检测增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax及PI3K/AKT信号通路相关蛋白PI3K和p-AKT的蛋白表达。

1.2.9PI3K/AKT信号通路抑制剂对心肌细胞的影响 10 μmol/L的PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002处理H9C2心肌细胞，通过CCK8法及流式细胞术分别检测GDF-15+H2O2组及PI3K/AKT信号通路抑制剂组的细胞活力及凋亡率，Western blot检测Ki67、Bcl-2、Bax、PI3K、p-AKT蛋白表达。

2 结果

2.1不同浓度H2O2对H9C2心肌细胞增殖的影响 由表1可知，不同浓度H2O2处理H9C2心肌细胞后，细胞活力均受到抑制，且有浓度依赖性(t25=2.867，P25=0.046；t50=4.628，P50=0.010；t100=8.457，P100=0.001；t200=15.084，P200=0.000；t400=19.574，P400=0.000)。由于200 μmol/L的H2O2处理H9C2心肌细胞后可抑制将近一半的细胞增殖，因此选择200 μmol/L的H2O2作为研究对象。

2.2各组细胞GDF-15表达检测 通过RT-PCR检测各组细胞中GDF-15的mRNA表达，Western blot检测GDF-15蛋白表达，结果如图1和表2所示，与Control组比较，H2O2组GDF-15的mRNA及蛋白表达均显著升高(tmRNA=12.802，PmRNA=0.000；t蛋白=6.590，P蛋白=0.003)，NC组GDF-15的mRNA及蛋白表达均无明显变化(P>0.05)；与H2O2组比较，GDF-15+H2O2组GDF-15的mRNA及蛋白表达均显著升高(tmRNA=8.183，PmRNA=0.001；t蛋白=6.086，P蛋白=0.004)。

2.3各组细胞活力检测 Control组、NC组、H2O2组和GDF-15+H2O2组的细胞活力分别为(100.00±4.62)%、(96.88±4.21)%、(55.12±3.69)%、(73.65±5.23)%，4组间比较差异有统计学意义(F=66.783,P<0.01)。与Control组比较，H2O2组细胞活力显著降低(t=13.147，P=0.000)，NC组细胞活力无明显变化(P>0.05)；与H2O2组比较，GDF-15+H2O2组的细胞活力显著升高(t=5.014，P=0.007)。见图2。

2.4各组细胞凋亡率检测 Control组、NC组、H2O2组和GDF- 15+H2O2组的细胞凋亡率分别为(3.65±0.53)%、(3.44±0.62)%、(23.26±1.65)%、(14.31±1.36)%，4组比较差异显著(F=207.989,P<0.01)。H2O2组细胞凋亡率显著高于Control组(t=19.599，P=0.000)，而GDF-15+H2O2组细胞凋亡显著低于H2O2组(t=7.250，P=0.002)。见图3。

表1不同浓度H2O2对H9C2心肌细胞增殖的影响

Tab.1EffectsofdifferentconcentrationsofH2O2onproliferationofH9C2cardiomyocytes

H2O2concentrationCellviability(%)0μmol/L10000±41525μmol/L9018±4241)50μmol/L8432±4151)100μmol/L7226±3881)200μmol/L5431±3211)400μmol/L4119±3141)F103144P<001

Note：Compared with 0 μmol/L,1)P<0.05.

图1 Western blot检测细胞中GDF-15的蛋白表达Fig.1 Western blot was used to detect protein expression of GDF-15 in cells

2.5各组细胞ROS水平检测 ROS水平检测结果如图4所示，Control组、NC组、H2O2组和GDF-15+H2O2组的ROS相对水平分别为(17.62±2.65)、(18.88±3.12)、(59.68±6.18)、(32.15±5.41)，4组比较差异具有显著统计学意义(F=54.388,P<0.01) 。H2O2组ROS水平显著高于Control组(t=10.831，P=0.000)，而GDF-15+H2O2组的ROS水平显著低于H2O2组(t=5.806，P=0.004)。

2.6各组细胞增殖凋亡相关蛋白表达检测 Control组、NC组、H2O2组和GDF-15+H2O2组Ki67的蛋白表达分别为(0.688±0.053)、(0.681±0.064)、(0.111±0.014)、(0.362±0.042)，Bcl-2的蛋白表达分别为(0.321±0.029)、 (0.335±0.032)、(0.097±0.010)、(0.212±0.021)，Bax的蛋白表达分别为(0.131±0.016)、(0.139±0.020)、(0.415±0.036)、(0.297±0.021)，H2O2组Ki67、Bcl-2的蛋白表达显著低于Control组(tKi67=18.231，PKi67=0.000；tBcl-2=12.648，PBcl-2=0.000)，Bax的蛋白表达显著高于Control组(t=12.486，P=0.000)；而GDF-15+H2O2组Ki67、Bcl-2的蛋白表达显著高于H2O2组(tKi67=9.820，PKi67=0.001；tBcl-2=8.564，PBcl-2=0.001)，Bax的蛋白表达显著低于H2O2组(t=4.904，P=0.008)。见图5。

表2各组细胞中GDF-15的mRNA表达及蛋白表达

Tab.2mRNAandproteinexpressionofGDF-15ineachgroupofcells

GroupsGDF⁃15mRNAexpressionGDF⁃1proteinexpressionControl1000±01110247±0032NC0955±01080221±0027H2O23144±02681)0436±00381)GDF⁃15+H2O25466±04122)0668±00542)F20740384001P<001<001

Note：Compared with Control group,1)P<0.05;compared with H2O2group,2)P<0.05.

2.7各组细胞PI3K/AKT信号通路PI3K、p-AKT的蛋白表达 Control组、NC组、H2O2组和GDF-15+H2O2组PI3K的蛋白表达分别为(0.462±0.041)、(0.445±0.048)、(0.118±0.012)、(0.302±0.021)，p-AKT的蛋白表达分别为(0.277±0.031)、(0.292±0.032)、(0.074±0.009)、(0.132±0.018)，4组的PI3K和p-AKT蛋白比较差异具有显著统计学意义(F1=66.840，F2=47.342，P<0.01)，H2O2组PI3K、p-AKT的蛋白表达均显著低于Control组(tPI3K=13.947，PPI3K=0.000；tp-AKT=10.892，Pp-AKT=0.000)，而GDF-15+H2O2组PI3K、p-AKT的蛋白表达均显著高于H2O2组(tPI3K=13.177，PPI3K=0.000；tp-AKT=4.992，Pp-AKT=0.008)。见图6。

图2 各组细胞活力检测结果Fig.2 Cell viability test results of each groupNote:Compared with Control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

图3 各组细胞凋亡率检测结果Fig.3 Apoptosis rate of each groupNote:A.The apoptosis rate of each group was detected by flow cytometry;B.The apoptosis rate of each group;compared with Control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

图4 各组细胞ROS水平检测结果Fig.4 ROS levels in each group of cellsNote:Compared with Control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

图5 各组细胞Ki67、Bcl-2、Bax蛋白表达检测结果Fig.5 Expression of Ki67,Bcl-2 and Bax proteins in each groupNote:A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of protein;compared with Control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

图6 各组细胞PI3K、p-AKT蛋白表达检测结果Fig.6 Expression of PI3K and p-AKT proteins in each groupNote:A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of protein;compared with control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

图7 PI3K/AKT信号通路抑制剂对心肌细胞凋亡的影响Fig.7 Effects of inhibitors of AKT signaling pathway on cardiomyocyte apotosis

图8 PI3K/AKT信号通路抑制剂对Ki67、Bcl-2、Bax、PI3K、p-AKT蛋白表达的Fig.8 Effects of inhibitors of PI3k/AKT signaling pathway on Ki67,Bcl-2，Bax,PI3K and p-AKT protein expressionNote: 1.GDF-15+H2O2 group;2.PI3K/AKT signaling pathway inhibitor group.

2.8PI3K/AKT信号通路抑制剂对心肌细胞的影响 GDF-15+H2O2组及PI3K/AKT信号抑制剂组的细胞活力分别为(97.88±2.45)%、(80.21±4.37)%，凋亡率分别为(13.75±1.02)%、(20.13±1.43)%，Ki67的蛋白表达分别为(0.352±0.036)、(0.215±0.026)，Bcl-2的蛋白表达分别为(0.182±0.020)、(0.115±0.013)，Bax的蛋白表达分别为(0.120±0.016)、(0.306±0.032)，PI3K的蛋白表达分别为(0.335±0.037)、(0.223±0.034)，p-AKT的蛋白表达分别为(0.091±0.011)、(0.037±0.008)，PI3K/AKT信号抑制剂组细胞活力及Bcl-2、PI3K和p-AKT的蛋白表达均显著低于GDF-15+H2O2组(t细胞活力=6.109，P细胞活力<0.05；tBcl-2=4.865，PBcl-2<0.05；tp-AKT=6.877，Pp-AKT<0.05)，细胞凋亡率及Bax蛋白表达显著高于GDF-15+H2O2组(t凋亡率=6.291，P凋亡率<0.05；tBax=9.005，PBax<0.05)。见图7，图8。

3 讨论

大量研究显示，多种心血管疾病在病理条件下会产生大量的活性氧及氧自由基，引起心肌细胞及组织的氧化应激损伤，从而诱导心肌细胞的凋亡[11-13]。降低由氧化应激导致的心肌细胞凋亡有重要的研究意义。GDF-15是一个分泌蛋白，是TGF-β家族成员之一，正常情况下在心脏中不表达或微量表达，而在心血管疾病的心脏中GDF-15的表达明显升高[14,15]。临床研究证实，GDF-15在外周血中的浓度与冠心病的发生发展相关，并且与心血管事件的发生和死亡率密切相关[16,17]；在小鼠的梗死心肌内，GDF-15蛋白快速诱导表达，这可能说明在梗死后的创面修复和愈合中GDF-15起到重要作用[18,19]；在心肌梗死诱导的心力衰竭大鼠心肌组织，心肌收缩功能LVEF指标可随心肌组织中GDF-15表达升高而降低[20,21]。以上的研究说明GDF-15在心血管疾病中的作用，但GDF-15对H2O2诱导的心肌细胞增殖凋亡的影响尚未清楚。

H2O2是常用的氧化应激损伤模型[22,23]。因此，本研究首先用不同浓度的H2O2处理心肌细胞，通过CCK8检测细胞增殖情况，以此确定H2O2的最佳浓度。接下来检测上调GDF-15表达对H2O2诱导的心肌细胞增殖凋亡的影响，发现上调GDF-15表达后心肌细胞的增殖显著升高，凋亡降低。这提示GDF-15可通过提高心肌细胞活力及降低凋亡对心肌细胞起保护作用。

GDF-15对心肌细胞增殖凋亡的影响是通过何种方式，目前也尚未明确。多种基因均可影响心肌细胞的增殖，如Ki67、PCNA等，ROS及Bcl-2和Bax可影响心肌细胞的凋亡。研究发现，病理状态下，ROS产生量增多，导致生物功能缺失及线粒体功能障碍，进而引起心肌细胞的损伤[24,25]。心肌细胞中长期有大量的ROS暴露时，也会引起心肌细胞的凋亡、纤维化、坏死，最后导致心律失常、心肌重构等[26,27]。Ki67是一种细胞增殖抗原，可以作为检测细胞增殖活性的一个重要指标，目前已得到广泛应用[28,29]。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中，Bax移位到线粒体膜上，导致膜电位发生变化，Bax空间构象变大从而发生活化。Bax发生活化后可诱导线粒体释放细胞色素C，从而诱导细胞的凋亡。Bcl-2和Bax可结合形成二聚体，抑制或促进细胞的凋亡[30,31]。已有多项研究证实可通过上调Bcl-2和下调Bax以降低心肌细胞的凋亡[32,33]。因此，本研究检测各组细胞中ROS水平及Ki67、Bcl-2和Bax蛋白表达，发现上调GDF-15表达后ROS水平降低，Ki67、Bcl-2表达上调，Bax表达下调。通过以上实验可初步推断上调GDF-15表达影响心肌细胞增殖凋亡的机制可能与降低ROS水平，上调Ki67、Bcl-2表达和下调Bax表达有关。

PI3K/AKT信号可影响细胞的增殖凋亡，通过调控下游的Bcl-2、Bax等多种靶蛋白，从而调控细胞的生物学过程[34,35]。研究显示，在H2O2诱导的心肌细胞氧化损伤中，可通过激活PI3K/AKT信号通路促进细胞的增殖及降低细胞凋亡[36-38]。PI3K激活的AKT可通过磷酸化作用抑制或激活下游的P21、Caspase9等靶蛋白，从而介导多种细胞因子、胰岛素等促进细胞增殖，并发挥抗凋亡作用[39,40]。本研究中为了证实上调GDF-15表达是否可引起心肌细胞PI3K/AKT信号的变化，通过Western blot检测PI3K和p-AKT的蛋白表达，结果显示，PI3K和p-AKT的蛋白表达均显著升高。这提示上调GDF-15表达可通过激活PI3K/AKT信号通路降低心肌细胞的氧化损伤。

综上所述，上调GDF-15表达可促进H2O2诱导的H9C2心肌细胞增殖，降低细胞凋亡，其机制可能与调节细胞中ROS水平，Ki67、Bcl-2、Bax表达及PI3K/AKT信号通路有关。本研究为GDF-15在心血管疾病心肌细胞增殖凋亡机制的研究奠定了一定基础。后续的研究将在体内对GDF-15的作用进一步实验验证。

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