深圳地区孕妇定植型B群链球菌流行病学特征

聂署萍，成子贤，王 琼，范菲楠，萧晓友，陆学东

(中山大学附属第八医院，深圳 518033)

B群链球菌(group Bstreptococcus, GBS)是一种定植在人类下消化道及泌尿生殖道的细菌，健康人群带菌率为15%～35% ，也是导致围产期母亲及新生儿严重感染的重要致病菌之一[1-2]。在围产期，孕妇阴道定植的GBS可以通过产道上行扩散感染子宫和胎膜，引起胎膜早破、早产、产褥感染、产后出血等多种产科并发症。在分娩期，细菌可由阴道逆行至羊水，胎儿在产程中吞咽或吸入GBS 感染的羊水，导致新生儿肺炎、败血症和脑膜炎等严重侵袭型感染，病死率高达50%[3]。GBS编码很多毒力因子，包括荚膜多糖、表面α-样蛋白(α-like protein，Alp)和菌毛等，不仅在GBS的致病机制中发挥着重要作用，还是疫苗研发的重要靶点[4-6]。青霉素是目前临床预防和治疗GBS感染的一线药物，然而对青霉素敏感性降低的菌株已有报道[7]。克林霉素和红霉素推荐用于治疗青霉素过敏人群的GBS感染，但由于其耐药水平的不断上升，能否继续作为抗GBS感染二线药物受到广泛质疑[8-11]。国内有关孕妇定植GBS流行情况的研究少见[2,12-13]。监测本地区孕妇定植GBS的血清型、毒力因子分布和耐药现状对围产期孕妇和新生儿GBS感染的预防、控制及疫苗的研发极其重要，现将检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2015年10月—2016年9月中山大学附属第八医院(深圳福田)、深圳市罗湖区人民医院和光明新区人民医院3所医院送检的孕妇GBS产前筛查阳性菌株56株。

1.2 菌种培养及鉴定 GBS采用哥伦比亚琼脂平板35°C在5% CO2的环境中培养18～24 h。菌种鉴定采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪结合CAMP试验进行。

1.3 GBS荚膜血清学分型 参考文献[14]，用多重聚合酶链反应(PCR)方法(QIAGEN公司)检测GBS荚膜血清型。菌株DNA抽提采用北京全式金细菌基因组抽提试剂盒，严格按照说明书进行操作。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶120 V电泳120 min 后，经凝胶成像系统观察结果。

1.4 GBS毒力因子检测 GBS菌体表面蛋白和菌毛蛋白检测：参考文献[15-16]，用多重PCR法检测GBSAlp基因(bca、eps、rib、alp2/3及alp4)和菌毛基因PI-I、PI-2a及PI-2b。直接根据PCR扩增片断大小判断目的基因存在与否。

1.5 GBS药敏试验及耐药基因检测 严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2015年标准，采用K-B纸片扩散法进行药敏试验。药敏纸片购自法国Oxide公司：青霉素G、四环素、红霉素、克林霉素、氯霉素以及左氧氟沙星。药敏培养基为含5%绵羊血Mueller-Hinton琼脂(购于安图生物)。采用双纸片扩散法(D试验)检测GBS对红霉素及克林霉素耐药表型，包括：对大环内酯-林可酰胺-链阳菌素B结构性耐药(constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance，cMLSB)，即红霉素和克林霉素均耐药；诱导性耐药(inducible MLSB resistance，iMLSB) 即红霉素耐药，靠近红霉素纸片一侧的克林霉素抑菌环出现“截平”现象，即D试验阳性；大环内脂类耐药型(macrolide resistance phenotype, M) 即红霉素耐药，克林霉素敏感，靠近红霉素纸片的一侧克林霉素抑菌环未出现“截平”现象，即D试验阴性[17]。GBS红霉素和四环素耐药基因检测：参考文献[18]，用多重PCR法检测红霉素耐药基因ermA、ermB、mefA/E，以及四环素耐药基因tetM、tetO、tetK及tetL，根据扩增片断大小判断耐药基因有无。

1.6 统计学分析 应用SPSS 20.0 统计软件进行数据处理。采用Fisher精确检验比较毒力因子和耐药基因在不同荚膜血清型中的分布差异，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBS的血清分型与毒力因子分布 56株无乳链球菌共检测出5种血清型，包括Ia、Ib、II、Ⅲ和V。其中Ia型6株(10.7%)，Ib型8株(14.3%)，II型2株(3.6%)，Ⅲ型34株(60.7%)，V型6株(10.7%)。部分菌株荚膜血清分型多重PCR电泳图见图1。除3株细菌外，其余53株细菌检出alp基因，其中以rib为主，占46.4%，eps、alp2/3 及bca检出率分别为25.0%、8.9%和14.3%，未检出alp4基因。所有菌株均检出至少一种菌毛基因，基因型以PI-2a+PI-1和PI-2b型为主，分别占37.5%、41.07%。表面蛋白基因和菌毛基因在各血清型中的分布见表1。部分血清型与特异表面蛋白及菌毛基因有明显相关性，如血清型Ia与eps、Ib与bca、III与rib、V与alp2/3，血清型Ib与PI-2a、III与PI-2b及V与PI-2a+PI-1(均P<0.05)。

M:DNA marker；-：阴性对照；其余为不同血清型的GBS

Figure1Multiplex PCR electrophoresis map of partial GBS strains with different capsule serotyps

2.2 药敏试验及耐药基因检测结果 56株GBS对青霉素全部敏感，对氯霉素、左氧氟沙星、红霉素、克林霉素、四环素有不同程度的耐药，耐药率分别为14.3%、23.2%、75.0%、67.9%及85.7%。42株红霉素耐药的GBS中包括36株cMLSB，4株M型及2株iMLSB表型。红霉素耐药菌株中耐药基因ermB的检出率最高，约88.1%，单独存在或与mefA/E共存，未检出ermA。V型血清型中有1株红霉素诱导性耐药菌株耐药基因检测均为阴性，可能存在其他耐药机制。48株四环素耐药菌株中tetM ，tetO及tetL检出率分别为87.5%、64.6%及6.25%。不同血清型GBS分布见表2。部分耐药基因与血清型有明显相关性，如血清型Ib与ermB、III与tetM+tetO(均P<0.05)。

表1 56株不同血清型GBS表面蛋白及菌毛蛋白基因分布(株)

表256株不同血清型GBS红霉素和四环素耐药的表型、基因型分布

Table2Distribution of erythromycin and tetracycline resistance phenotypes and genotypes of 56 GBS strains with different serotypes

血清型菌株数红霉素耐药菌株数表型(菌株数)基因型(菌株数)四环素耐药菌株数基因型(菌株数)Ⅰa63M(2)、cMLSB(1)mefA/E(2)、ermB(1)6tetM(4)、tetM+tetO(2)Ⅰb87iMLSB(1)、cMLSB(6)mefA/E+ermB(1)、ermB(6)6tetM(2)、tetO(2)、tetM+tetO(2)Ⅱ21cMLSB(1)mefA/E+ermB(1)1tetM(1)Ⅲ3425M(2)、cMLSB(23)mefA/E(2)、mefA/E+ermB(12)、ermB(11)30tetM(2)、tetO(4)、tetM+tetO(21)、tetM+tetL(3)Ⅴ66iMLSB(1)、cMLSB(5)mefA/E+ermB(2)、ermB(3)5tetM(5)

3 讨论

GBS是定植在健康女性阴道中的正常菌群之一，我国孕妇的带菌率约为5%～15%[12-13]。GBS可以通过产道上行扩散感染子宫和胎膜，使孕妇发生晚期流产、早产、胎膜早破，还可引起绒毛羊膜炎、产褥感染等。分娩期带菌孕妇则易在生产过程中将GBS 传染给新生儿，引起新生儿肺炎、脑膜炎和败血症等严重侵袭性感染[1-3]。二十世纪90年代初发达国家推行的GBS产前筛查及分娩期预防性使用抗菌药物，有效减低了围产期孕妇和新生儿GBS感染的发病率和病死率，但由于各种原因这些措施在我国还未广泛推广[1,19-21]。

GBS编码很多与致病力相关的毒力因子，其中荚膜多糖能帮助细菌产生免疫逃逸，促进细菌的定植或侵袭，已成为疫苗研究的主要靶点。根据荚膜多糖抗原特异性的不同，GBS被分为10个血清型，包括Ia、Ib及II-IX，其中与新生儿侵袭性感染相关的血清型主要为Ia、II、III及V型[1,4]。孕妇定植GBS的血清型在不同国家和地区分布不同，如美国及部分欧洲国家主要为Ia、II、III及V型，VI-IX罕见，而马来西亚主要为VI、VII及III型，非洲加蓬81%的孕妇定植GBS血清型为V、III及Ib[22-24]。本地区的研究结果与我国北京地区相似，以III、Ia、V及 Ib等血清型为主[13]。目前，正在研发的覆盖5种血清型(Ia、Ib、II、III及V)的荚膜结合疫苗，如果将来在本地区投入使用能很好的预防新生儿GBS感染[4]。

此外，GBS Alp和菌毛也是重要的毒力因子及疫苗靶点。Alp由5个不同等位基因alpha-C、epsilon、alp2/3、rib及alp4编码，能介导细菌对宫颈上皮细胞的侵袭。除3株细菌外，本研究中其余53株GBS均检出一种alp基因，以rib为主，约46.4%，eps、alp2/3及bca的检出率分别为25.0%、8.9%和14.3%，未检出alp4。本研究还发现GBS的alp基因与特定的血清型有明显相关性，如血清型Ia与esp、Ib与bca、III与rib、V型与alp2/3等，而马来西亚Eskandarian等[23]报道rib与Ia、VI、II及III型相关。北京地区报道V型与alp2/3、III与rib、Ia与eps及Ib型与alp2/3有明显相关性[13]。菌毛样结构参与细菌对宿主细胞的黏附和定植，根据编码菌毛的等位基因的不同，被分为三型：PI-1、PI-2a及PI-2b，每株细菌至少含有其中一型[6.16]。本研究中所有菌株均检出至少一型菌毛，菌毛基因型以PI-2a+PI-1和PI-2b型为主，分别占37.5%和41.07%；菌毛类型与特异血清型分布也有明显相关性，如血清型Ib与PI-2a、III型与PI-2b、V型与PI-2a+PI-1，而Eskandarian等[23]报道血清型III与PI+PI-2a、Ia型与PI-2a有明显相关性，表明不同地区Alp和菌毛的分布有明显差异。因此，了解本地区孕妇定植GBS毒力因子分布及流行情况对有效预防围产期孕妇和新生儿的侵袭性疾病有重要意义。

青霉素是目前临床预防和治疗GBS感染的一线药物，然而对青霉素敏感性降低的菌株已有报道[7]。克林霉素和红霉素推荐用于治疗青霉素过敏人群的GBS感染，但由于其耐药水平的不断上升，克林霉素和红霉素能否继续作为抗GBS感染二线药物受到广泛质疑[8-9]。GBS对大环内酯类抗生素耐药的主要机制是由erm基因介导的核糖体靶位点甲基化修饰，从而引起的细菌MLSB交叉耐药。此外，GBS对红霉素的耐药机制还包括mefA/E基因介导的外排作用，导致细菌对14、15元大环内酯耐药(M型)。细菌对四环素的耐药机制通常由tetM或tetO基因介导，且与大环内酯类耐药基因位于同一可移动元件上[17-18]。本研究药敏试验结果显示，所有细菌对青霉素皆敏感，表明青霉素仍可作为治疗和预防GBS感染的一线药物。与其他报道[23-24]相似，本地区GBS对四环素有很高的耐药率(85.7%)，耐药基因主要为tetM 、tetO。但本地区GBS对红霉素和克林霉素的耐药率高于其他地区(马来西亚红霉素耐药率为23.3 %，克林霉素为17.5%)[23]。因此，建议对青霉素过敏的孕妇选用红霉素或克林霉素进行抗GBS治疗之前，应先进行药敏试验再合理选择抗菌药物。42株红霉素耐药的GBS中包括36株cMLSB、4株M型及2株iMLSB表型。红霉素耐药菌株中耐药基因ermB的检出率最高，约88.1%，单独存在或与mefA/E共存，未检出ermA。部分血清型与特异耐药基因有明显相关性，如血清型Ib与ermB、III型与tetM+tetO。

综上所述，本研究通过了解本地区孕妇定植的GBS荚膜血清型及主要毒力因子分布，监测GBS对不同抗菌药物的耐药情况并研究其相关的耐药机制，为GBS疫苗的研发，感染性疾病的预防控制及治疗提供理论基础。但本研究范围小，样本数不足，一定程度上影响GBS流行病学研究结果的完整性。

[参 考 文 献]

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