万古霉素和非达霉素对艰难梭菌体外抗菌活性的稳定性

赵杏珍，赵建宏，魏宏莲，杨 靖，李志荣，强翠欣，李茹鑫,2，王晓明，赵宝鑫，翟 宇

(1 河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000； 2 河北省临床检验中心，河北 石家庄 050000)

艰难梭菌是一种专性厌氧革兰阳性产气荚膜梭菌，约15%～39%抗菌药物相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhea，AAD) 由艰难梭菌感染(Clostridiumdifficile，CDI)引起[1]，感染症状可由轻度腹泻到重度假膜性结肠炎，严重时可引起死亡[2]。艰难梭菌在健康成人中的定植率约5.5%，在健康儿童中定植率则高达13.6%[3]。2004年以来高产毒艰难梭菌流行株(NAP1/BI/027)在欧美国家的暴发流行更引起了特别关注。在美国，艰难梭菌已经逐渐取代耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)成为医疗保健相关性感染(healthcare-associated infection，HAI)的首要病原菌[4]。

2014年欧洲临床微生物学会和传染病学会发布的艰难梭菌感染(CDI)的更新治疗指南指出，轻度CDI患者建议口服甲硝唑治疗，重度CDI患者则建议口服万古霉素治疗，非达霉素可用作轻度和重度CDI患者的备选药物，对于治疗后首次复发或多次复发的CDI患者，推荐使用非达霉素作为治疗药物[5]。早在1994年甲硝唑就开始用于治疗CDI，但是，近年来甲硝唑治疗失败的报道有所增加[6-8]。万古霉素用于治疗首次感染的CDI十分有效。非达霉素是专门用于治疗CDI的新型药物，具有对肠道菌群影响小，复发率低等优点[9]。因此，万古霉素和非达霉素在CDI治疗中深受临床医生的欢迎。迄今为止，关于艰难梭菌对以上两种药物耐药的报道非常少见，但是，在抗菌药物压力下导致的细菌耐药问题依然是不可忽视的。本研究首次采用多步诱导法对河北地区15株临床分离艰难梭菌和5株标准菌株进行诱导试验，并采用琼脂稀释法测定诱导前后艰难梭菌对万古霉素和非达霉素的MIC值，以期检测万古霉素和非达霉素对艰难梭菌体外抗菌活性的稳定性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 20株艰难梭菌均来自河北省医学微生物保藏库(Hebei Provincial Bank for Medical Culture Collection，HBMCC)。15株临床分离的菌株的核糖体分型按本实验室统一命名，其中HB1/RT001型2株，HB5/RT017型3株，HB6/RT012型3株，HB3型3株，HB24型1株，HB25型3株。HB1、HB5、HB6分别对应核糖体分型的国际命名RT001、RT017、RT012。5株标准菌株分别是ATCC 700057、ATCC 1382、ATCC 9689、ATCC 43598和ATCC 1870，购自英国OXOID公司。所有菌株均通过VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统，Microflex LT基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪和16S rDNA测序鉴定。

1.2 试剂与仪器 非达霉素由华北制药股份有限公司提供(批号20131001)；万古霉素购自中国药品生物制品鉴定所(批号200301)；艰难梭菌拉氧头孢诺氟沙星(CDMN)基础琼脂和添加剂购自英国OXOID公司；无菌脱纤维羊血购自北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DM2000、100bp ladder、Es Taq MasterMix(含染料)购自北京康为世纪科技有限公司；维生素K、琼脂糖、Goldview、PRB等引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；布鲁氏肉汤、布鲁氏琼脂均购自美国BD公司；氯化血红素购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠购自天津市大陆化学试剂厂；超低温冰箱购自海尔公司；生物安全柜购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；全自动高压蒸汽灭菌仪购自日本ALP公司；精密分析天平购自日本A&D公司；高速冷冻离心机购自美国Thermo公司；厌氧培养系统购自广州尤德公司；多点接种仪购自日本佐久间制作所；比浊仪购自法国生物梅里埃公司；VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统购自法国生物梅里埃公司；Microflex LT基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪购自德国Bruker Daltonics公司；16S rDNA测序由生工生物工程有限公司完成。

1.3 药敏试验 采用琼脂稀释法检测20株艰难梭菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，药敏方法及判读标准参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的《厌氧菌药物敏感性试验方法》[10]。万古霉素耐药折点参考欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)标准[11]：万古霉素>2 μg/mL。对非达霉素的耐药折点目前尚无确定数据。依据临床三期试验数据，艰难梭菌对非达霉素的MIC集中在0.25 μg/mL[12]。质控菌株为ATCC 700057。

1.4 体外多步诱导试验 采用琼脂稀释法检测菌株的初始MIC值，用于计算诱导时所需的药物浓度，将冷冻的艰难梭菌在强化布鲁氏血平板上传代两次后，接种到分别含有万古霉素和非达霉素药物浓度为1/2倍MIC(各个菌株的初始MIC值)的强化布鲁氏血琼脂平板上，37℃厌氧环境下连续传代10次，并在第10次传代后对20株艰难梭菌进行药敏试验检测MIC值；然后将药物浓度提升到1倍MIC继续传代10次，并在第20次传代后对诱导的菌株再次进行药敏试验检测MIC值；最后比较所有菌株初始MIC值和诱导20代后MIC值。为了保证MIC结果的稳定性，每次在测定艰难梭菌MIC值之前，将诱导后的菌株在不含抗生素的布鲁氏血琼脂培养基中传代3次，见图1。

图1 检测菌落传代培养流程

2 结果

20株艰难梭菌菌株体外诱导前对万古霉素的MIC范围在0.125～0.50 μg/mL之间，诱导20代后MIC范围在0.50～2.00 μg/mL之间；其中3株菌的MIC出现4倍增长，4株菌的MIC值不变，13株菌的MIC出现2倍增长；所有菌株对万古霉素均敏感。20株艰难梭菌菌株体外诱导前对非达霉素的MIC范围在0.015～0.50 μg/mL之间，诱导后MIC范围在0.0075～0.50 μg/mL；其中13株菌的MIC值基本不变或出现2倍增长，3株菌的MIC值出现8倍增长，4株菌的MIC值出现4倍增长。此外，艰难梭菌对非达霉素的MIC值均小于或等于万古霉素，且未发现各菌株诱导前后MIC值的变化与核糖体型别有关。各菌株诱导前后的MIC值见表1。

3 讨论

本研究通过体外诱导的方法分析万古霉素和非达霉素对15株临床分离艰难梭菌及5株标准菌株体外抗菌活性的稳定性。研究结果显示20株艰难梭菌对万古霉素的MIC范围在0.125～0.50 μg/mL之间(万古霉素耐药折点为>2 μg/mL)；所有菌株对万古霉素均敏感，且诱导20代后菌株MIC依然在0.50～2.00 μg/mL之间，其中3株菌的MIC出现4倍增长，4株菌的MIC值不变，13株菌的MIC出现2倍增长，MIC虽然有微小变化，但总体上诱导前后所有菌株对万古霉素的敏感性变化不大，这也说明万古霉素体外抗艰难梭菌活性稳定性较好，万古霉素虽然用于治疗CDI的时间较长，但不易出现继发耐药。此外，本次研究虽未出现万古霉素耐药株，但是有1株菌对万古霉素敏感性略降低(MIC=2.00 μg/mL)，今后在临床应用中应密切关注艰难梭菌对万古霉素的MIC值，防止出现万古霉素耐药。 迄今为止，也曾有一些文献报道过对万古霉素敏感性下降的艰难梭菌，但数量十分有限。如2013年中国Dong等[13]分离到2株万古霉素敏感性下降株(MIC值为8 μg/mL)；台湾地区Chia等[14]报道了5株敏感性下降株(MIC>2 μg/mL)；伊朗Goudarzi等[15]报道2株MIC值为4 μg/mL的菌株；2016年Leeds等[16]通过体外诱导获取了2株万古霉素耐药株(MIC值为16 μg/mL)，同时还通过基因测序技术发现了3个突变位点，包括MurG(参与肽聚糖的合成)108位上脯氨酸突变为亮氨酸(P108L)、rpoC(编码β/亚基)上天冬氨酸突变为酪氨酸(D244Y)和CD3659上谷氨酸突变为终止密码子(E327stop)。万古霉素是糖肽类抗生素，主要通过干扰细菌细胞壁结构中的肽聚糖起到杀灭作用，因此，MurG上的突变可能与耐药相关，但是MurG突变是否介导耐药，以及介导耐药后产生的适应性代价如何尚无定论。而rpoC和CD3659的突变并不涉及万古霉素的作用机制，其与万古霉素的耐药是否相关还有待进一步的研究验证。

表1万古霉素和非达霉素对艰难梭菌体外诱导前后的药敏结果(μg/mL)

Table1Antimicrobial susceptibility testing results ofC.difficilebefore and after in vitro induced by vancomycin and amphotericin (μg/mL)

菌株万古霉素初始MIC第一次诱导后MIC第二次诱导后MIC非达霉素初始MIC第一次诱导后MIC第二次诱导后MICHB1(RT001) 2011092700250.250.500.500.030.030.0075 2017030810470.500.501.000.500.500.50 ATCC96890.250.500.500.0150.0150.0075HB5(RT017) 2017030810480.500.500.500.1250.06250.50 2017030810490.500.250.500.030.06250.03 2010110500090.1250.500.500.030.06250.0625 ATCC435980.250.500.500.030.1250.0625HB6(RT012) 2010101500050.250.500.500.030.1250.03 2010102300060.1250.500.500.030.030.25 2011101800290.250.500.500.030.030.125 ATCC13820.250.500.500.030.0150.015HB3 2011041100150.250.500.500.030.06250.0625 2017030810500.250.250.500.030.030.0075 2012092001980.500.500.500.030.030.25HB24 2014050105940.250.06250.500.030.06250.25HB25 2012092001990.250.500.500.030.1250.125 2012092202050.500.501.000.030.030.0625 2012101502190.250.500.500.030.1250.125RT027 ATCC18700.502.002.000.030.06250.015RT038 ATCC7000570.501.000.500.030.030.015

另外，本研究结果还显示20株艰难梭菌对非达霉素的MIC范围在0.015～0.50 μg/mL，诱导后各菌株MIC范围在0.0075～0.50 μg/mL之间，MIC范围与国外报道一致，且多数菌株对非达霉素的MIC明显低于万古霉素。2014年Eitel等[17]研究显示188株艰难梭菌对非达霉素的MIC范围是介于0.008～0.5 μg/mL；2009年Citron等[18]测定了38株艰难梭菌对非达霉素的MIC值，结果显示027型艰难梭菌MIC值在0.03～0.25 μg/mL之间，非027型艰难梭菌MIC值在0.008～0.25 μg/mL之间；2014年Rashid等[19]研究了32种不同核糖体分型共114株艰难梭菌对非达霉素的MIC，结果显示各菌株对非达霉素的MIC在0.008～0.125 μg/mL之间，并且各型别菌株对非达霉素的敏感性无统计学差异。以上结果提示非达霉素对艰难梭菌抗菌活性较强，且与万古霉素相比，非达霉素对艰难梭菌的敏感性更强。此外，非达霉素诱导前后20株艰难梭菌中13株菌的MIC值相对不变，3株菌的MIC值出现8倍增长，4株菌的MIC值出现4倍增长，但总体上，艰难梭菌对非达霉素仍十分敏感，提示非达霉素对艰难梭菌的体外抗菌活性的稳定性良好，可能因为非达霉素是近些年刚刚上市的新型药物， 2011年获美国食品药品管理局(FDA)批准上市，用于治疗CDI的时间尚短；也可能与非达霉素的抗菌机制有关，非达霉素是一种大环内酯类的窄谱抗生素，对革兰阳性厌氧菌，尤其是对艰难梭菌和产气荚膜梭菌有很好的抗菌效果。非达霉素的作用机制主要是通过抑制细菌RNA聚合酶从而阻止转录过程。非达霉素先与DNA-RNA聚合酶复合物结合后，抑制σ亚基及DNA的解链，在没有转录生成信使RNA时即阻止细菌的转录[20]。

目前，关于非达霉素对艰难梭菌敏感性的文献报道相对较少。2011年Seddon等[21]报道了2株MIC值增高4～8倍的艰难梭菌，基因测序后发现β亚基上三种氨基酸突变(G1074K、V1143F、V1143D)，以及β′亚基上D237Y突变。2012年Seddon等[22]又在体外诱导出两株MIC提高64倍的艰难梭菌，测序后发现β亚基上V1143G、V1143D、Q1074K、Q1074H和V1143G突变，β′亚基上R89G、I10R和R89G突变。2014年Babakhani等[23]也在体外诱导出1株16倍MIC值的艰难梭菌，测序发现β亚基上Q1074K和Q1143F，β′亚基上D237Y改变。但是上述文献并没有对各个突变与耐药之间的关系进行后续报道，此外，由于诱导方法的差异、缺少重复性验证等因素使结果出现不一致，需进一步的研究证实以上研究结果是否具有生物学意义。

万古霉素不易被肠道吸收，因此，肠道内药物浓度高、作用持久、全身毒性小；非达霉素安全、肠道吸收少、对正常菌群影响小、结肠内药物分布浓度高。强翠欣等[24]曾通过构建黄金地鼠艰难梭菌相关性腹泻的动物模型发现非达霉素对高产毒艰难梭菌有较好的体内抗菌作用，并且与万古霉素相比，治疗复发率低。万古霉素和非达霉素在治疗CDI过程中效果较好，因此，临床医生对这些药物较为重视。本次的研究结果显示，万古霉素和非达霉素对艰难梭菌体外抗菌活性的稳定性均较好，且艰难梭菌在体外不断地接受这两种抗菌药物的压力，也不易产生继发耐药，所以临床上可放心使用万古霉素和非达霉素治疗CDI。

本研究在国内首次采用体外多步诱导法检测万古霉素和非达霉素对艰难梭菌体外抗菌活性的稳定性。万古霉素是治疗CDI的首选药物，非达霉素是治疗CDI的新兴药物，了解两种药物对艰难梭菌抗菌活性的稳定性可为指导临床用药提供参考依据。但是，本研究也存在一些局限性，如菌株数量较少，且菌株主要来自河北地区，有地域局限性。将来我们还会继续密切观察，扩大病例数来追踪万古霉素和非达霉素在临床应用中的疗效，及时发现并预防耐药情况的发生。

[参 考 文 献]

[1] Karas JA, Enoch DA, Aliyu SH. A review of mortality due toClostridiumdifficileinfection[J]. J Infect, 2010, 61(1): 1-8.

[2] Butala P, Divino CM. Surgical aspects of fulminantClostridiumdifficilecolitis[J]. Am J Surg, 2010, 200(1): 131-135.

[3] Tian TT, Zhao JH, Yang J, et al. Molecular characterization ofClostridiumdifficileisolates from human subjects and the environment[J]. PloS One, 2016, 11(3): e0151964.

[4] Miller BA, Chen LF, Sexton DJ, et al. Comparison of the burdens of hospital-onset, healthcare facility-associatedClostridiumdifficileinfection and of healthcare-associated infection due to methicillin-resistantStaphylococcusaureusin community hospitals[J]. Infect Control Hosp Epidemiol, 2011, 32(4): 387-390.

[5] Debast SB, Bauer M P, Kuijper EJ, et al. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the treatment guidance document forClostridiumdifficileinfection[J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(Suppl 2): 1-26.

[6] Johnson S, Sanchez JL, Gerding DN. Metmnidazole rsistance inClostridiumdifficile[J]. CIin Infect Dis, 2000, 3l(2): 625-626.

[7] Peláez T, Alcalá L, Alonso R, et al. Reassessment ofClostridiumdifficilesusceptibility to metronidazole and vancomycin[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(6): 1647-1650.

[8] Peláez T, Alcalá L, Alonso R, et al. In vitro activity of ramoplanin againstClostridiumdifficile, including strains with reduced susceptibility to vancomycin or with resistance to metr-onidazole[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(3): 1157-1159.

[9] Goldstein EJ, Babakhani F, Citron DM. Antimicrobial activities of fidaxomicin[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55 (Suppl 2): S143-S148.

[10] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria. Approved standard M100-S22[S]. CLSI, 2012.

[11] European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. 2011. Clinical breakpoint tables, version 1.3[S]. EUCAST, London, United Kingdom.

[12] Goldstein EJ, Citron DM, Sears P, et al. Comparative susceptibilities to fidaxomicin (OPT-80) of isolates collected at baseline, recurrence, and failure from patients in two phase III trials of fidaxomicin againstClostridiumdifficileinfection[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(11): 5194-5199.

[13] Dong D, Zhang L, Chen, X, et al. Antimicrobial susceptibility and resistance mechanisms of clinicalClostridiumdifficilefrom a Chinese tertiary hospital[J]. Int J Antimicrob Agents, 2013, 41(1): 80-84.

[14] Chia JH, Lai HC, Su LH, et al. Molecular epidemiology ofClostridiumdifficileat a medical center in Taiwan: persis-tence of genetically clustering of A-B+ isolates and increase of A+B+ isolates[J]. PLoS One, 2013, 8(10): e75471.

[15] Goudarzi M, Goudarzi H, Alebouyeh M, et al. Antimicrobial susceptibility ofClostridiumdifficileclinical isolates in Iran[J]. Iran Red Crescent Med J, 2013, 15(8): 704-711.

[16] Leeds JA, Sachdeva M, Mullin S, et al. In vitro selection, via serial passage, ofClostridiumdifficilemutants with reduced susceptibility to fidaxomicin or vancomycin[J]. J Antimicrob Chemother, 2014, 69(1): 41-44.

[17] Eitel Z, Terhes G, Sóki J, et al. Investigation of the MICs of fidaxomicin and other antibiotics against HungarianClostridiumdifficileisolates[J]. Anaerobe, 2015, 31: 47-49.

[18] Citron DM, Babakhani F, Goldstein EJ, et al. Typing and susceptibility of bacterial isolates from the fidaxomicin (OPT-80) phase II study forC.difficileinfection[J]. Anaerobe, 2009, 15(6): 234-236.

[19] Rashid MU, Dalhoff A, Weintraub A, et al. In vitro activity of MCB3681 againstClostridiumdifficilestrains[J]. Anae-robe, 2014, 28: 216-219.

[20] Artsimovitch I, Seddon J, Sears P. Fidaxomicin is an inhibitor of the initiation of bacterial RNA synthesis[J]. Clin Infect Dis, 2012, 55(Suppl 2): S127-S131.

[21] Seddon JBF, Gomez A, Artsimovitch I, et al. RNA ploymerase targe modification inClostridiumdifficilewith reduced susceptibility to fidaxomicin[C]. In 51st ICAAC, Chicago, 2011.

[22] Seddon JBE, Sears P. Mutant prevention concentration of fi-daxomicin forClostridiumdifficile[C]. In 52nd ICAAC, San Francisco, 2012.

[23] Babakhani F, Seddon J, Sears P. Comparative microbiological studies of transcription inhibitors fidaxomicin and the rifamycins inClostridiumdifficile[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2014, 58(5): 2934-2937.

[24] 强翠欣, 杨靖, 白玉, 等. 非达霉素和万古霉素对黄金地鼠艰难梭菌相关性腹泻动物模型治疗效果的评价: 第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛[C].长沙, 2015.