NanoLuc标记的重组克里米亚-刚果出血热病毒及其初步用于抗病毒药物筛选

夏菡 袁志明 Dennis Bente

430071武汉,中国科学院武汉病毒研究所(夏菡、袁志明)；77555加尔维斯顿,美国德州大学医学分部微生物与免疫系(Dennis Bente)

克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever,CCHF),在我国又称“新疆出血热”,是一种以蜱为主要传播媒介的烈性传染病,病死率高达40%[1-2]。其致病原克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)的基因组为3节段负链RNA：S基因编码病毒核蛋白(nucleoprotein,NP),M基因编码一个多聚蛋白(glycoprotein,GP),L基因编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRp)[3-4]。CCHF长期在非洲、巴尔干、中东和亚洲流行,随着全球气候变化、媒介蜱活动范围扩大和贸易活动增加,CCHF在我国再暴发和扩散的风险存在[5-11]。当前对于CCHFV致病机理和病毒媒介宿主相互作用等研究不足,且无有效的特异性药物或疫苗,为了保障国家生物安全,需要加强对其研究。

NanoLuc荧光素酶(nanoluciferase)是目前性能最好的生物发光报告基因之一,大小为绿色荧光蛋白(GFP)的三分之二,亮度比萤火虫荧光素酶(luciferase)高240倍[12]。本研究利用反向遗传学操作方法,通过对CCHFV M节段的修饰,获得可表达NanoLuc荧光素酶的重组CCHFV(recombinant CCHFV,rCCHFV),并使用利巴韦林和Furin抑制剂评估其用于快速药物初筛的可行性。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒、抗病毒化合物和试剂SW13细胞(比利时鲁汶大学P.Leyssen教授惠赠)培养于含10%小牛血清、1%青霉素/链霉素、1 mmol/L丙酮酸钠的DMEM培养基；BSR-T7/5细胞(德国慕尼黑大学K.K.Conzelmann教授惠赠),使用含5%小牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基和含5%小牛血清、1%青霉素/链霉素、1 mg/ml G418的DMEM培养基交替培养；含野生型 IbAr10200 CCHFV基因的转录质粒(pT7-S、pT7-M和 pT7-L)及表达质粒(pC-N和pC-L opti)由美国疾病预防控制中心Bergeron Eric研究员惠赠；pNL1.1质粒和Nano-Glo荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；In-Fusion克隆试剂盒和NucleoBond© Xtra质粒提取试剂盒购自Clotech公司；利巴韦林(Ribavirin)和Furin抑制剂(Furin Inhibitor)购自 Sigma公司；TransIT-LT1转染试剂购自Mirus公司；细胞培养用的血清、抗生素和DMEM培养基均购自Gibco公司。

1.2 研究方法

1.2.1 pT7-M-mucin_NLuc的构建：以pNL1.1为模板,引物NL_mucin_F和 NL_mucin_R(表1)扩增NanoLuc编码框(约0.7 kb)；以pT7-M为模板,NL_mucin_vectorF和NL_mucin_vectorR为引物(表1)扩增载体片段(约8.5 kb)；依据In-Fusion克隆试剂盒的说明进行操作并涂布LB抗性(Amp 100μg/ml)平板,置于37℃培养箱中,12～24 h后挑取克隆；使用PCR、酶切和测序确认阳性克隆。

表1 pT7-M-mucin_NLuc构建所用的引物Tab.1 Sequence of primers for pT7-M-mucin_NLuc construction

1.2.2 NanoLuc rCCHFV的拯救和NanoLuc荧光素酶信号检测：转染前1 d,准备新鲜的BSR-T7/5 6孔板(3.0×105细胞/孔)；16～24 h后,将2.5μg pT7-M-mucin_NLuc 与 1 μg pT7-S、1μg pT7-L、0.66 μg pC-N和0.33μg pC-L质粒混匀于250μl Opti-MEM中,再以2.5μl/μg的比例向其中加入TransIT-LT1,混合均匀室温放置20 min[13]；向细胞培养板中加入转染复合体,放回37℃培养箱继续培养96 h；取上述BSR-T7/5细胞转染后上清,转移到新鲜的SW13 6孔板(1～2 ml上清/孔),放回37℃培养箱中；3～5 d后观察,如出现细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),则取相应的细胞上清进行NanoLuc发光信号检测和TCID50测定；按照Nano-Glo荧光素酶检测试剂盒和EnVisionTM多功能检测仪(PerkinElmer)使用说明检测并读取光信号(relative light unit,RLU)。

1.2.3 评估rCCHFV用于体外抗病毒药物高通量快速初筛的可行性：准备SW13 96孔板；24 h后,弃培养基,每孔加入200μl利巴韦林(10μmol/L)+rCCHFV(0.01 MOI)、Furin抑制剂(10 μmol/L)+rCCHFV(0.01 MOI)、rCCHFV(0.01 MOI)或正常细胞对照(各3个复孔)；培养1～2 h后,弃孔中液体,PBS洗涤2次后再加入200μl含10μmol/L利巴韦林或Furin抑制剂的培养基或空白培养基,放回培养箱；处理后1～4 d,测定RLU值,分析比较待评估化合物对NanoLuc rCCHFV的抑制效果。

图1 重组克里米亚-刚果出血热病毒的设计(A)和pT7-M-Mucin_NLuc的酶切验证(B)Fig.1 (a)The strategy for rCCHFV construction and(b)the restriction enzyme digestion conformation for plasmid pT7-M-Mucin_NLuc

图2 重组克里米亚-刚果出血热病毒感染SW13细胞后产生的细胞病变效应(A)和重组克里米亚-刚果出血热现毒感染细胞上清中相对光单位与半数组织感染剂量(B)Fig.2 (a)Cytopathic effect caused by recombinant CCHFV in SW13 cells and(b)the RLU and TCID50 value in cell supernatant infected by recombinant CCHFV

1.2.4 统计学方法：相关性和ANOVA方差分析分别使用 R语言(https：//www.r-project.org/)中的Package stats version 3.2.5中的cor.test,aov和TukeyHSD分析方法完成。

2 结果

2.1 rCCHFV的设计和pT7-M-mucin_Nluc的获得为了使NanoLuc信号的检测更加方便,设计将NanoLuc的开放读码框(open reading frame,ORF)连接到mucin的ORF后,中间使用GGGS进行连接,以减少外源基因对mucin的影响,见图1(A)。经过PCR筛选的阳性重组质粒使用SnaBI单酶切获得了与预期大小一致的8.9 kb片段,使用SnaBI/XmaI双酶切获得了与预期大小一致的两个片段(2.3 kb和6.6 kb),见图1(B)。随后测序结果也进一步证实成功获得了序列正确的pT7-M-Mucin_NLuc质粒。

2.2 NanoLuc荧光素酶标记的r CCHFV的基本特征成功获得1株 NanoLuc荧光素酶标记的rCCHFV,将其命名为 rCCHFV-mucin_NLuc。rCCHFV-mucin_NLuc感染SW13细胞的第3天,可见明显的CPE出现,表现为细胞死亡或脱落,见图2(A)。通过对rCCHFV-mucin_NLuc感染后1～4 d细胞上清中的RLU和TCID50进行测定,并对两者的相关性进行分析,结果表明RLU与TCID50呈正相关,相关系数cor=0.998,P=0.001。

2.3 用于抗病毒药物高通量快速初筛的可行性评估每次取微量细胞上清(10μl)进行NanoLuc荧光素酶信号RLU测定,耗时＜5 min,RLU值越低,表明药物对病毒的抑制效果越好。未经过处理的rCCHFV感染孔,RLU值于感染后第3或4天达到峰值,在10μmol/L浓度下,Furin抑制剂处理后第1天到第3天,感染细胞上清中RLU值与利巴韦林处理组无显著差异(P＞0.1),但在第4天,Fruin抑制剂处理组的RLU值显著高于利巴韦林处理组(P=0.001),且与未处理病毒对照组无明显差异(P＞0.1)(图3和表2)。因此,初筛结果表明Furin抑制剂不适合作为CCHFV的抗病毒药物。

图3 利巴韦林和Furin抑制剂处理后重组克里米亚-刚果出血热病毒的相对光单位Fig.3 The RLU value for rCCHFV after Ribvirin or Furin inhibitor treatment

表2 利巴韦林和Furin抑制剂处理后组间相对光单位的方差分析Tab.2 The ANOVA analysis for the relative light unit value after treated by Ribavirin or Furin inhibitor

3 讨论

CCHFV反向遗传系统的建立难度极大,直到2015年其全病毒拯救系统才由Bergeron等成功建立[13-15]。目前带报告基因的重组病毒已被广泛用于抗病毒药物筛选、病毒复制、病毒入侵和活体成像等研究。NanoLuc基因分子量非常小,可以最大限度减少外源基因对病毒的干扰,目前已成功用于多种重组病毒的构建,例如NanoLuc重组流感病毒、辛德毕斯病毒和基孔肯雅病毒、乙型肝炎病毒和狂犬病病毒用于药物筛选、活体成像、病毒生物特性等研究[16-19]。CCHFV感染细胞后,mucin蛋白大量分泌到胞外,本研究成功将NanoLuc基因整合其mucin编码框后,获得带NanoLuc标记的rCCHFV。该重组病毒在感染SW13细胞后的3～4 d滴度达峰值,且可以将NanoLuc分泌到胞外,因此不需要裂解仅从细胞上清中取样即可测定RLU值。同时RLU值与TCID50呈高度正相关,可以实时反映病毒的增殖状况,且耗时极短。该方法也存在不足,NanoLuc检测试剂加入后需要在30 min内完成测定过程,否则存在信号衰减而影响结果的准确性。

已有报道表明利巴韦林在体外可抑制CCHFV复制,本研究以利巴韦林为阳性对照,Furin抑制剂作为候选化合物,快速测定其体外对重组病毒的抑制作用。初筛结果表明,利巴韦林与已报道的结果一致,对CCHFV体外复制具有抑制作用,但是Furin抑制剂的效果差于利巴韦林,不适合作为CCHFV的抗病毒候选药物继续进行深入的评估。在药物浓度为10μmol/L条件下,阳性药物利巴韦林处理后1～4 d,RLU值和未处理对照组相比降低约2个数量级,具有显著差异。而Furin抑制剂处理组尽管在处理后1～3 d RLU值与利巴韦林处理组无明显差异,但是在处理后第4天RLU值显著高于利巴韦林处理组(P≤0.01),且与未处理组无显著差异(P＞0.1)。Furin蛋白酶在促进 mucin蛋白分泌到胞外过程起到作用,这可能是Furin抑制剂处理后一段时间内感染上清中RLU值有所降低的原因之一。今后的研究中,可以利用本重组病毒,对大量的待评估药物进行快速初步筛选,缩小目标范围,为抗CCHFV药物的研发提供技术支持。

利益冲突无