乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物多重耐药宿主免疫因子水平的研究

付丽娟 张怡 张亚男 高巍 陈岩

150036哈尔滨,黑龙江省医院感染内科(付丽娟高巍 陈岩),检验科(张亚男)；150040哈尔滨,黑龙江省中医药大学附属第一医院外三科(张怡)

固有免疫是是机体抵御病原体入侵和扩散的第一道防线,也是机体免疫防御的基础。病原体感染机体后,固有免疫首先调动起来抑制病原体的复制,并清除病原体。固有免疫的特点是反应快且具有普遍性。机体的固有免疫系统主要包括：物理和化学的各种屏障,各种细胞如吞噬细胞、释放炎症因子的细胞、NK细胞等以及各种细胞因子等[1]。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染作为世界性的公共卫生难题严重危害人类健康。HBV侵入机体后,于肝细胞的细胞核及胞浆中复制、装配、释放导致更多细胞感染[2]。同时机体调动固有免疫及特异性免疫应答将病毒清除。目前机体的固有免疫在抗HBV中的作用受到众多学者关注,但针对核苷(酸)类似物抗HBV治疗导致耐药的慢乙肝患者机体的固有免疫状态研究较少。核苷(酸)类似物抗HBV耐药是HBV DNA出现耐药位点变异,导致核苷(酸)类似物抗病毒疗效下降[3]。核苷(酸)类似物耐药是否会导致宿主的固有免疫状态发生变化,这种变化是耐药引起的,还是固有免疫状态的变化促进了核苷(酸)类似物的耐药,研究较少。新发现的与抗病毒有关的固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10、TRIM22 的表达有助于机体清除乙肝病毒[4-5],但在长期应用核苷(酸)类似物抗病毒治疗导致耐药的患者中固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10、TRIM22的表达情况尚不明确,是否固有免疫因子 IFN-α、IFN-γ、Mov10,TRIM22 的表达水平与核苷(酸)类似物耐药机制有关。因此本研究通过检测核苷(酸)类似物耐药患者的固有免疫因子IFN-α、IFN-γ、Mov10 和 TRIM22 的 mRNA 表达水平,探讨导致核苷(酸)类似物耐药的宿主固有免疫机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者应用核苷(酸)类似物抗病毒治疗出现临床耐药患者28例,交叉耐药患者10例,多重耐药患者18例,患者来自黑龙江省医院感染内科2011年12月份至2015年1月份门诊及病房就诊患者。20例健康对照者来自黑龙江省医院体检中心。所有入选患者及健康体检者均知情同意。(1)入选病例的诊断标准符合2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》[6]。(2)既往服用核苷(酸)类似物药物持续时间≥6个月。(3)核苷(酸)类似物联合或序贯治疗应用药物种类≥2种。(4)核苷(酸)类似物抗病毒治疗出现原发性治疗失败、部分病毒学应答、病毒学突破、生化学突破。(5)分组标准：交叉耐药(cross resistance)：是指针对一种抗病毒药物出现耐药变异对另一种或几种抗病毒药物也出现耐药。多重耐药(multidrug resistance)：是指耐药位点不同的药物进行单药序贯或联合治疗时,HBV可在不同药物的靶位上出现耐药变异,从而产生变异病毒株,且对多种药物耐药。对两种核苷(酸)类似物耐药的为交叉耐药组；对两种以上核苷(酸)类似物耐药的为多重耐药组。(6)排除标准：停药复发患者；同时合并有HCV、HDV、HEV、HIV感染；合并自身免疫性肝病及其他自身免疫性疾病；合并遗传代谢性肝脏疾病；妊娠或哺乳期妇女；合并严重其他系统疾病或精神疾病者。健康对照组(1)既往否认肝脏疾病史(否认乙肝、丙肝、丁肝、酒精肝、自身免疫性肝病史)。(2)生化学正常。(3)乙肝五项检查结果：HBsAg(-)、HBsAb(+)或(-)；HBeAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)。(4)梅毒及 HIV抗体阴性。(5)自身抗体系列：阴性。(6)无长期饮酒史。(7)近6个月未服用过任何药物。(8)无其他系统性疾病(如脑梗塞、高血压、糖尿病、肿瘤,自身免疫性疾病等)。

1.2 固有免疫因子mRNA表达水平检测健康对照组及入选病例组每人均采集静脉血4ml,EDTA抗凝,人淋巴细胞分离液,按说明书操作分离外周血单个核细胞。Trizol法提取PBMC总RNA。提取得到的RNA质量用紫外分光光度计检测。SYBR Real-Time PCR检测试剂盒(TaKaRa公司)；按照试剂盒说明书完成操作。RT-PCR引物序列见表1。

1.3 统计学方法变量不服从正态分布,组间差异比较采用Kruskal-Wallis非参数检验方法；变量不服从正态分布,相关分析采用spearman秩相关分析。

表1 相关基因逆转录mRNA引物参考序列Tab.1 Reference sequences of the primers for relevant genes reverse transcription mRNA

2 结果

2.1 耐药组及正常对照组固有免疫因子 IFN-α,Mov10,IFN-γ和TRIM22的mRNA表达耐药组与正常对照组固有免疫因子 IFN-α、Mov10、IFN-γ和TRIM22的mRNA表达比较,耐药组固有免疫因子Mov10、TRIM22的mRNA表达水平较正常对照组显著升高,差异具有统计学意义(P＜0.01)(图1,A、B)。 两组间 IFN-α、IFN-γ的 mRNA 表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)(图1,C、D)。

2.2 耐药组固有免疫因子TRIM22、Mov10、IFN-α和IFN-γ的mRNA表达相关性分析机体固有免疫因子IFN-α,Mov10,IFN-γ,TRIM22均具有抗乙肝病毒作用,其作用机制不同,其互相之间也具有相关性。经统计学分析,TRIM22 mRNA表达水平与IFN-α mRNA,IFN-γ mRNA,Mov10 mRNA 表达水平均相关(图 2,A、B、C)；Mov10 mRNA 表达水平与TRIM22 mRNA、IFN-αmRNA表达水平具有相关性,与IFN-γmRNA表达水平无相关性(图2,C、D、E)；IFN-αmRNA表达水平与 TRIM22 mRNA,Mov10 mRNA,IFN-γmRNA表达水平均相关(图2,A、D、F)。

2.3 多重耐药组与交叉耐药组各免疫因子mRNA表达水平比较多重耐药组与交叉耐药组固有免疫因子 TRIM22、Mov10、IFN-α 和 IFN-γ 的 mRNA表达水平相互比较差异无统计学意义(P＞0.05)(见图3)。

3 讨论

目前众多学者研究已证实固有免疫因子Mov10、TRIM22、IFN-α、IFN-γ 具有抗病毒作用。 人的Mov10基因位于1号染色体短臂1P13.2,主要在胚胎干细胞、睾丸、胸腺等器官表达。研究证实[7-8]HIV感染的Mov10小鼠模型体内无病毒血症发生,说明Mov10模型小鼠具有抗HIV的作用。Mov10可以在多个阶段抑制HIV复制：Mov10以RNA依赖的方式与HIV-1核酸蛋白相互作用,从而抑制HIV的包装；Mov10属于SF-1RNA解螺旋酶,它在RNA干扰途径起重要作用,是RNA干扰抗病毒途径的重要参与者；Mov10基因编码的mRNA处理体(P小体)的标志蛋白可有效的嵌合入病毒体内,减少病毒感染。人类TRIM基因家族编码的蛋白有70多种,TRIM22又名为Staf 50。TRIM蛋白作为机体固有免疫因子参与宿主的防御机制主要是伴随干扰素和病毒刺激干扰病毒的转录[9]。TRIM蛋白抗病毒的机制[10-11]主要是调节正常蛋白代谢和清除降解病毒蛋白,TRIM22具有泛素E3连接酶活性在体外IFN-α可诱导TRIM22的上调,进一步增强其抗病毒功能；灵长类的TRIM22蛋白可被干扰素诱导上调,在抗病毒固有免疫中起到重要的作用；在人TRIM5aC端的SPRY结构域能特异识别HIV-1的核衣壳CA,抑制衣壳蛋白CA的脱壳从而抗HIV复制。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质在机体的固有免疫中起重要作用。病毒、细菌感染会诱导生成Ⅰ型干扰素,T细胞的免疫应答会诱导生成Ⅱ型干扰素,干扰素具有抗感染(细菌、病毒),提升机体免疫应答作用[12]。

图1 耐药组与正常对照组固有免疫因子mRNA表达水平比较A.Mov10 mRNA； B.TRIM22 mRNA； C.INF-α mRNA； D.INF-γ mRNAFig.1 The mRNA level of inherent immune factors in drug-resistant group compared with the normal control group

图2 耐药组固有免疫因子TRIM22、Mov10、IFN-α和IFN-γ的mRNA表达相关性A：TRIM22 与 IFN-α；B：TRIM22 与 IFN-γ；C：Mov10 与 TRIM22；D：Mov10 与 IFN-α；E：Mov10 与 IFN-γ；F：IFN-α 与 IFN-γFig.2 The correlation of mRNA levels of the inherent immune factors including IFN-α,Mov10,IFN-γ,TRIM22A：TRIM22 and IFN-α；B：TRIM22 and IFN-γ；C：Mov10 and TRIM22；D：Mov10 and IFN-α；E：Mov10 and IFN-γ；F：IFN-α and IFN-γ

图3 多重耐药组与交叉耐药组固有免疫因子TRIM22(A)、Mov10 m(B)、IFN-α(C)和IFN-γ(D)的mRNA表达水平比较Fig.3 The mRNA levels of inherent immune factors including TRIM22(A),Mov10(B),IFN-α(C)and IFN-γ(D)in the multidrug resistant group and cross resistance group

本研究发现在耐药组CHB患者PBMC中Mov10 mRNA、TRIM22 mRNA的表达水平较正常对照组明显升高,具有统计学意义(P＜0.01)。表明应用核苷酸类似物抗病毒治疗的过程中,随着HBV DNA耐药株的增多,Mov10、TRIM22表达亦增强,有利于机体抑制HBV DNA复制以及清除病毒。但也有报道TRIM22 mRNA表达在未治疗的CHB患者中是明显降低的,表明其免疫功能下降,其推断TRIM22是HBV感染的伴随指标[13]。本研究中核苷酸类似物耐药组中TRIM22 mRNA表达明显升高,推测在抗耐药HBV中TRIM22发挥重要作用。TRIM22作为固有免疫因子参与机体的免疫反应,亦反映机体的免疫状态,其在未治疗的CHBHBV DNA患者中是明显降低的,推测此类患者机体免疫状态尚未激活,或处于乙肝免疫耐受状态,固有免疫因子TRIM22表达降低,而本研究中耐药CHB患者处以免疫激活期,在核苷类药物治疗过程中出现HBV DNA耐药,TRIM22高表达与机体免疫系统清除病毒相关,具体的相关机制尚需进一步深入研究。耐药CHB组 IFN-αmRNA、IFN-γmRNA表达与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),表明机体固有免疫抗耐药HBV机制不是通过干扰素途径达到抗病毒作用的。耐药的HBV不能刺激机体使IFN-α mRNA、IFN-γ mRNA 表达上调,清除乙肝病毒耐药株,耐药株持续存在,导致临床抗病毒疗效差,病情进展。本课题还探讨了在耐药组中这4个固有免疫因子的相关性,发现耐药组中 TRIM22 mRNA表达水平与 IFN-αmRNA,Mov10 mRNA和IFN-γmRNA均呈正相关,表明 TRIM22抗耐药HBV机制与多种固有免疫因子相关,推论它在抗耐药HBV中起重要作用。另外,Mov10 mRNA表达水平与IFN-αmRNA和TRIM22 mRNA的表达呈正相关,与IFN-γmRNA无关,推测Mov10抗耐药HBV机制不是通过干扰素激发的免疫途径清除病毒的。IFN-α mRNA 表达水平与 IFN-γ mRNA、Mov10 mRNA、TRIM22 mRNA表达正相关,可推论 IFN-α mRNA表达与其他固有免疫因子在抗耐药HBV过程中起到协同抗病毒作用。固有免疫因子间的相关性较为复杂,机制仍不明确,尚需进一步研究。

总之,本研究结果表明核苷(酸)类似物抗HBV治疗出现临床交叉耐药及多耐药的发生与机体的固有免疫因子有相关性,但具体的发生机制还需进一步深入研究。

利益冲突无