人偏肺病毒检测方法研究进展

王超 郑丽舒

100052北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARI)是一种导致全球人群发病和死亡的主要病因,2001年首次鉴定出的人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)已被证实在各年龄段都能引起ARI,且几乎所有5岁以下的儿童都感染过hMPV[1]。人血清中hMPV抗体检测结果表明,该病毒至少从20世纪50年代起就一直在人群中传播[2]。虽然hMPV感染所致症状一般表现温和,但在特殊人群中也能引发致死性并发症,因此建立及时准确有效的检测方法很重要。

1 hMPV分子特点及致病性

hMPV属于单分子负链RNA病毒目,副粘病毒科,肺病毒亚科,肺病毒属。基因组长约13.3kb[3],可分为A、B两型,根据G基因和F基因序列的不同,进一步将其分为A1、A2、B1和B2四个亚型[4],其中A2还可分为A2a和A2b基因簇[5]。hMPV基因组为单负链RNA,包含8个蛋白编码基因,编码9个蛋白,从3′端到5′端依次为N-P-M-F-M2-SH-GL,分别为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、转录延长因子(M2-1)、RNA合成调节因子(M2-2)、小疏水糖蛋白(SH)、粘附蛋白(G)和病毒聚合酶(L)。 病毒RNA 与P、N、L、M2-1、M2-2蛋白共同形成直径为17 nm的核衣壳,表面有由M蛋白和脂质形成的包膜,包膜上含有由F、G和SH组成的刺突。在F蛋白和G蛋白的参与下,hMPV与细胞表面硫酸肝素受体结合进入细胞。

hMPV感染在免疫功能正常的个体中症状表现很温和,但对于早产儿、儿童、老年人和免疫受损患者,hMPV可以导致显著的发病率和死亡率。据报道,32.7%hMPV感染患儿为有早产史的学龄前儿童,这些患儿患哮喘的机率更高[6]。hMPV感染还可导致足月孕妇的急性呼吸窘迫综合征[7],引发婴儿呼吸道感染合并难治性癫痫持续状态和重症脑炎[8]。在恶性血液病患者中hMPV感染导致的重症肺炎可合并多器官功能衰竭[9]。此外,hMPV还能在肺移植患者中引发严重感染[10]。一般来说,hMPV感染在ARI患者中所占的比例为4% ～16%[11],但不同地域和不同年份感染率会有所变化[12]。hMPV感染患者在临床症状上与呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)感染十分相似[13],一般仅表现为轻度上呼吸道感染,严重者出现危及生命的细支气管炎和肺炎,很难从临床角度判断感染病毒种类,因此建立合适特异的实验室检测方法极为必要。

2 hMPV检测方法的研究

2.1 分离培养hMPV在很多传代细胞系中都能分离培养,如 Vero、HEp-2、Hep G2、293 和 LLC-MK2等[14-15],培养过程中需外源加入 TPCK胰酶对hMPV的 F蛋白进行切割以获得感染性[2,16]。hMPV复制动力学很慢,出现细胞病变(CPE)时间晚,在不同细胞系中CPE的表现不同,有时还需盲传培养,实验周期长,所以目前临床诊断很少用到细胞培养。但作为检测病毒感染的金标准[17],细胞培养具有简便、低成本和不需要复杂器械等优点,适合普通实验室操作。细胞培养能直观反映病毒与细胞间的相互作用,是病毒学和临床研究的基础,寻找合适有效的病毒分离培养方法具有十分重要的研究意义。

Reina等[18]通过Shell Vial Cultures技术对临床hMPV感染的呼吸道样本进行培养,结果表明这能成为一种快速、可靠的临床实验室诊断方法。Isaeva等[19]用19种人和动物细胞系培养hMPV,发现hMPV对人类细胞中的clone 1-5C4株和猫肾细胞CRFK最敏感。Sato等[20]使用人恶性黑色素瘤细胞MNT-1培养hMPV,发现相对于LLC-MK2和Vero E6,MNT-1能更早出现合胞体病变。此外,hMPV能在人正常呼吸道上皮细胞(BEAS-2B、16HBE140)中良好复制产生包涵体,且不需要外源加入TPCK胰酶[3,14],但也有研究表明hMPV在原代和传代细胞系中感染率没有差别[21]。利用Transwell培养板建立起的3D立体培养原代人呼吸道组织细胞(HAE)模型也可用于hMPV的感染研究[22],该模型能以更接近人体真实的环境揭示hMPV的感染机制和进行药物评价。

2.2 核酸检测

2.2.1 PCR方法：由于hMPV在细胞中生长缓慢,临床检测主要采用逆转录PCR(RT-PCR)方法。hMPV N基因在核酸序列和氨基酸序列都是最保守的(分别为91.2%和98.4%),常用于hMPV检测,G基因是差异最大的(分别为79%和59.2%)[23],可用于分型,通过real time RT-PCR扩增hMPV这两个基因,进行测序就可以鉴别诊断出hMPV的四种亚型[24]。另有研究显示仅检测N基因也能鉴定出aMPV和hMPV所有亚型[25]。此外,还可通过逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)法扩增hMPV M基因来鉴别hMPV的A、B型,该法具有较高的特异性和灵敏度,且不需要复杂的仪器,适用于实验条件简单的现场检测[26]。由于呼吸道感染多为混合感染,逐个排查费时费力,利用FRET杂交探针和 SYBR Green染料[27-28]建立多重实时荧光定量检测PCR方法能一次检测多种DNA和RNA病毒,具有降低本低,简便快捷等优点。BioFire公司通过微流控技术发明的FilmArray Respiratory Panel(FilmArray RP)是一种集样品制备、扩增、检测和分析功能于一体的多重PCR系统,可用于检测急性呼吸道感染中常见病毒、细菌或真菌,具有简单、高效、快速的特点[29]。

2.2.2 核酸测序：RNA病毒由于基因组容易变异,除选择高度保守的区域进行PCR检测之外,常需要结合测序进行确认。测序技术能够准确提供hMPV流行株的变异情况,为研究hMPV致病机制提供依据。西班牙巴塞罗那儿童hMPV感染曾出现一种180 bp重复片段突变株,这种突变株很快成为了当季流行株[30]。日本横滨地区临床hMPV样本G基因测序分析时,也发现有46.9% 的 A2b基因簇hMPV G基因产生了180 bp重复片段突变,该突变导致G蛋白产生了60个氨基酸残基的重复序列,是O链糖的潜在受体,可能导致hMPV对宿主免疫逃逸[31]。此外,近年兴起的二代测序和三代测序技术能够及时提供更为准确有效的测序信息。

2.2.3 xMAP和xTAG技术：xMAP和xTAG技术是Luminex公司自创的荧光微球编码技术和标签技术,是临床应用型生物芯片主要采用的技术之一,已广泛用于生命科学的各个领域。Luminex在此基础上发明的xTAGRespiratory Viral Panel(RVP呼吸道病毒检测试剂盒)可同时检测19种呼吸道病毒及亚型,而相对于 xTAG RVP,Luminex 2015年推出NxTag respiratory pathogen panel(NxTAG RPP)还能同时检测肺炎支原体和肺炎衣原体,对于某些病毒有更好的灵敏度[32]。与多重RT-PCR技术相比,NxTag技术也有高特异性、高灵敏度,操作更方便快捷等优点。研究者也可根据自己的实验需求灵活应用xMAP和xTAG技术,Yan等[33]在xMAP技术上融合多重RT-PCR技术建立了高通量多路液相芯片(rMLA),可同时检测6种常见呼吸道病毒。

2.3 血清学检测与抗原检测

2.3.1 酶联免疫吸附法(ELISA)：hMPV编码三种表面蛋白,F、G和SH蛋白,其中F蛋白可以诱导有效的中和抗体,而G蛋白和SH蛋白的免疫原性很弱。采用单一重组抗原的ELISA只能检测血清中一种hMPV抗体,不能准确反映病毒感染情况,而Okamoto等[34]利用hMPV全部抗原建立的ELISA方法可以检测患者血清中所有hMPV抗体,适用于临床实验室检查和大规模筛查。此外,将金属增强荧光法(MEF)与ELISA方法结合,通过高通量金属增强荧光生物传感器(HT-MEFB)检测hMPV抗体,能显著提高ELISA检测的灵敏度[35]。

2.3.2 免疫荧光标记法：免疫荧光标记法分为直接免疫荧光法(DIF)和间接免疫荧光法(IFA),其中DIF因能在短时间特异地检测病原体,是实验室检测hMPV的常用方法。但也有研究表明虽然DIF有很高的特异性(99%),但检测灵敏度却很低(38%),不适用于临床实验室检测[36]。相对于DIF,IFA在灵敏度和特异性上均高一些,hMPV小鼠单克隆抗体(mAb)能够特异识别hMPV的N蛋白,灵敏度达到100%[37]。免疫荧光标记法的局限性在于其检测设备较贵且结果需要人为解读,阳性判断的主观性较强。

2.4 其他检测方法质谱(MS)技术具有快速、灵敏、特异、高通量、低成本的特点,广泛用于细菌的检测,但在病毒检测的应用还很少。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术可用于检测临床样本和分离培养样本中的hMPV蛋白质组[38]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术也可用于检测呼吸道病毒,相对于LC-MS/MS,MALDI-TOF MS能更迅速的鉴定病毒的型别,但LC-MS/MS具有更高的灵敏度,能够鉴定出样本中不同病毒[39]。质谱技术检测呼吸道病毒对临床样本的要求较高,需要进行前期处理并优化处理条件。

3 小结

hMPV是一种重要的呼吸道病毒,患者对于hMPV感染难以产生持久的免疫,常产生复发感染,截至目前,hMPV感染仍是常规的抗病毒治疗和对症治疗,没有疫苗。实验室检测hMPV主要采用PCR和DIF,但完善传统的细胞培养方法及新建立的质谱方法能为hMPV检测提供更全面的信息,根据不同的实验需求采用不同的检测方法更有助于研究hMPV的分子流行病学、抗病毒药物和疫苗研发,以加强未来对hMPV的预防和控制能力。

利益冲突无