肠道病毒71型3D蛋白结构与功能研究进展

温小菁 陶泽新 温红玲

250012济南,山东大学公共卫生学院微生物检验学系感染性疾病防控重点实验室(温小菁、温红玲)；250014济南,山东省疾病预防控制中心山东省传染病预防控制重点实验室(陶泽新)

肠道病毒71(EV71)和柯萨奇病毒A16(Coxsackie virus A16,CV-A16)都是引发手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原体。与CV-A16不同的是EV71感染常导致重症HFMD的发生[1]。大多数HFMD的患儿症状轻微,主要的临床表现为发热,手部、足部、臀部等部位出疹和口腔黏膜疱疹。EV71还可侵染患儿的中枢神经系统,诱发多种神经系统并发症,如无菌性脑膜炎、脊髓炎,以及神经源性心肌炎等,甚至引起患儿死亡[2]。最近几年,EV71引发的HFMD在亚洲地区多个国家广泛流行[3]。在中国,2008—2016年累计报告HFMD患儿共16 291 933例,死亡3 515例[4],严重威胁着我国儿童的健康,死亡病例大多由EV71感染导致,但其致病机制尚未明确。迄今为止,尚缺乏针对EV71感染的有效的抗病毒药物。3D蛋白是一种RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp),是病毒复制不可缺少的酶,在病毒复制过程中发挥着重要作用。通过对3D蛋白结构与功能的研究可进一步的了解EV71致病机制,并为抗病毒药物研发提供靶标。

1 EV71病毒的基本结构和形态

EV71病毒属小核糖核酸病毒科,病毒颗粒无包膜,其衣壳是20～30 nm的正二十面体立体对称结构。EV71的病毒核酸属单股正链RNA,基因组含7 000多个核苷酸,两侧分别是高度保守的5′UTR和带有多聚核苷酸尾的3′UTR,只含一个开放阅读框架(open reading framework,ORF),编码含有约2 100个氨基酸的多聚蛋白,该多聚蛋白可进一步水解为P1、P2、P3 3个前体蛋白。P3亦可水解为4种非结构蛋白：3A、3B、3C和3D[5]。有研究显示在病毒复制过程中,非结构蛋白发挥着至关重要的作用[6]。

2 EV71 3D蛋白的基本结构

EV71 3D蛋白含有约462个氨基酸,相对分子质量为53×103。EV71 3D蛋白的晶体结构于2010年首次被解析出,像闭合的人的右手手掌,包含“手指”、“拇指”、“手掌”等结构域[7],与脊髓灰质炎病毒(PV)的3D蛋白晶体结构相比,EV71 3D蛋白的晶体结构具有更宽敞的拇指结构域。N-端结构域将手指结构域与拇指结构域连接在一起,手指结构域能与模板发生结合,拇指结构域则与引物发生相互作用。另外,3D蛋白具有6个由氨基酸组成的保守区域,分别为 Motif A、B、C、D、E、F,在其他正链RNA病毒中也是如此,其中3D蛋白活性位点GDD位于Motif C上。EV71 3D蛋白存在两处不同于其他蛋白的地方：Motif E位于“手掌”区域,Motif F位于“手指”区域[8],这可能与其在病毒复制过程中的作用有关。“手指”区域还可以进一步细分为：“食指”、“小指”、“中指”、“无名指”等区域。 X 射线衍射分析揭示了EV71 3D蛋白对核苷酸或核苷酸类似物具有很高的亲和力,据此可得到EV71 3D蛋白与核苷酸或核苷酸类似物形成的复合物的高分辨率的电子密度图。

3 EV71 3D的功能

EV71 3D蛋白是由病毒基因组编码的,主要负责病毒RNA的复制[5,9]。3D蛋白可参与VPg的尿苷酰化反应,位于3D蛋白手掌区域底部的311位点是VPg结合位点,结合后能够稳定VPg分子,VPg在病毒复制起始中扮演重要角色[10],因此3D蛋白可通过VPg起始蛋白复制。在3D蛋白的作用下,病毒以自身RNA为模板复制出负链RNA,再以自身复制出的RNA为模板,复制得到子代正链RNA。即3D蛋白主要负责EV71病毒基因组的合成与延伸[11-12]。下面将从3D蛋白对病毒复制、激活炎性反应、减弱干扰素的抗病毒活性等方面进行阐述。

3.1 3D蛋白对病毒复制的作用有研究显示SUMO(small ubiquitin-like modifier)化修饰和泛素化修饰均可作用于3D蛋白,后者依赖于前者,SUMO化修饰是一种翻译后修饰,这种修饰具有调节蛋白质的功能,两种修饰都具有增强3D蛋白稳定性的作用,因而可通过对蛋白质的调节来促进病毒复制[13]。残基K159和L150/D151/L152负责3D蛋白的SUMO化,若SUMO化位点突变则会影响3D蛋白的活性及病毒的复制。若提高EV71感染细胞中SUMO-1的水平,能增加3D蛋白的SUMO化和泛素化水平,继而导致EV71的复制增强。而在3C蛋白中情况则相反,3C的SUMO化会使3C发生降解并且最终将导致病毒复制的减少。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是柯萨奇病毒B3和EV71有效复制所必需的[14]。

EV71可利用宿主细胞的修饰进行自身的有效复制。此外EV71的3D蛋白还可以通过阻滞细胞周期为EV71的产生提供有利条件。柯萨奇病毒A16中也可出现以上情形[15-17]。Yu等[18]研究显示,3D通过增强cyclin E1的表达和CDK2 T160的磷酸化诱导S期控制蛋白的表达谱,使细胞周期停滞于S期,从而可以促进EV71的复制。相反,G0/G1和G2/M阻滞却可抑制EV71复制。研究结果还显示在EV71感染后,细胞周期蛋白E1表达上调,而细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1表达下调,在24～30 h间S期阻滞最为明显,且仅在被完整病毒感染的细胞中才能检测到显著的S期阻滞。以上内容可以得出调节与细胞周期相关的多种细胞因子的转录水平和翻译后水平可支持病毒复制。据报道[19],一些病毒可通过操纵细胞周期蛋白和CDK进程来调节细胞周期的进程。3D蛋白促进病毒复制的途径还可通过作用于PI3K/AKT/m TOR信号通路引发宿主细胞凋亡,继而促进复制[20]。有研究显示[21],在对3D蛋白的第251位氨基酸进行突变后,在35℃培养时突变体的病毒复制基本未发生改变,而在39.5℃培养时突变体病毒的复制比35℃培养时减少了100倍,病毒的复制能力也相应的下降。第251位氨基酸位于3D蛋白结构的手指域和手掌域motifA之间的α-螺旋中。作为对照在对3D蛋白的第328位氨基酸进行突变后,病毒的复制能力未发生改变。这表明3D蛋白第251位氨基酸可能是EV71的毒力位点,且该位点可能具有温度敏感性。Barton等[22]研究显示脊髓灰质炎病毒3DM394T突变体的起始复制复合物中的负链RNA的合成在34℃时显示正常,而在39.5℃时负链RNA的合成迅速受到抑制,且该抑制不可逆。Arita等[23]研究显示将脊髓灰质炎病毒株的温度敏感位点引入到EV71的3D编码区中,EV71毒株也表现出了很强的温度敏感性,复制能力发生了相应的改变。由此可看出3D蛋白中可能含有影响病毒毒力的位点。

3.2 3D蛋白可以激活炎性反应先天性免疫系统是一个高度保守的信号网络体系,对于保护宿主感染和清除入侵病原体非常重要[24]。先天性免疫应答的一个重要组成部分是炎性体的激活,一种蛋白的胞质复合物激活Casp-1将产生促炎性细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)[25]。 病毒感染宿主后,宿主可通过启动自身的免疫系统来清除入侵的病原体,从而达到保护自身的作用。NLRP3炎性体的活化是先天性免疫应答的重要组成部分之一,在调节宿主免疫和病毒感染中起重要作用,在其暴露于病原体时可被诱导,随后活化的NLRP3炎性体可以调节IL-1β的成熟,IL-1β随后通过激活免疫细胞并诱导许多次级促炎细胞因子而在炎症反应中起关键作用。NLRP3可识别包括肠道病毒71在内的许多RNA病毒来调节先天免疫和病毒复制[26]。Wang等[27]研究表明,EV71通过激活NLRP3炎性体诱导巨噬细胞和外周血单核细胞中IL-1β的产生和分泌,EV71 3D聚合酶通过与NLRP3结合形成特定的环状结构3D-NLRP3-ASC来促进NLRP3炎性复合体的组装,从而导致IL-1β的活化。在环状复合体中,3D位于最里层,中间两层分别是3D-NLRP3复合体和NLRP3-ASC复合体,ASC位于结构体的外部。NLRP3包含 3个重要的域,分别是：PYD,NACHT和LRR。其中NACHT和LRR域可与3D蛋白发生相互作用。此外,3D还改变了NLRP3、ASC和pro-Casp-1的亚细胞分布,并与炎性体成分共定位与NLRP3结合形成大斑点。研究发现的3D蛋白激活炎性反应这一功能与病毒的复制密切相关,将会为病毒感染的预防和治疗提供思路。

3.3 3D蛋白能减弱干扰素的抗病毒活性干扰素可通过多种方式发挥其抗病毒活性,可通过抑制病毒组分的转录和翻译而干扰病毒的复制。I型干扰素对体外和体内EV71感染具有抗病毒活性[28]。EV71感染可能改变IFN-α反应,导致逃避抗病毒策略和免疫发病机制。Wang等[29]研究显示,EV71 3D可减弱IFN-r诱导的STAT1酪氨酸磷酸化继而减弱干扰素的抗病毒活性。在3D表达的细胞中STAT1的表达减少不仅体现在蛋白水平还体现在mRNA水平,在此过程中IFN-r受体的表达不会受到干扰。同样的EV71 2A蛋白也可通过减弱IFN-r诱导的STAT1的丝氨酸磷酸化减弱干扰素的抗病毒活性,促进病毒复制。EV71可通过几种免疫逃避策略来减弱I型干扰素应答。在3D表达细胞中STAT1的额外表达显著逆转了IFN-r诱导的IRF1转录激活的降低。3D蛋白可能有助于先天免疫的逃避。3D蛋白如何调控STAT1的活化和表达仍旧是未知的,还需要更多的实验来证实。

4 有关抑制剂对3D蛋白功能的影响

3D蛋白是一种RNA聚合酶,宿主细胞中不存在这种RNA聚合酶,因此研究3D蛋白的结构和功能可为抗病毒药物的研发提供思路。迄今还未开发出针对3D蛋白的抗病毒药物,可从3D蛋白的晶体结构入手,根据3D蛋白的晶体结构特征研制相关的抑制剂,用于防治EV71引发的HFMD。

金黄三羧酸(aurintricarboxylic acid,ATA)是一种对细胞功能具有多效性的独特化合物,是EV71复制的有效抑制剂。Hung等[30]研究显示,ATA能够抑制病毒编码的3D蛋白的活性,继而有效地抑制EV71的复制。且该抑制作用发生在病毒复制周期的早期阶段。3C和2 A蛋白酶的活性却不受ATA的影响。据报道ATA可抑制吸附,从而通过干扰病毒包膜糖蛋白(gp120)和细胞表面上的CD4受体之间的相互作用来阻断HIV的复制[31]。Chen等[32]报道ATA也是HCV的NS5B复制酶抑制剂。此外,ATA对EV71的抑制可能不仅仅是由于对3D蛋白抑制所致,还需要进一步的研究来探究ATA是否可作用于影响EV71复制的其他蛋白或细胞。

DTriP-22(4{4-[(2-bromo-phenyl)-(3-methylthiophen-2-yl)-methyl]-piperazin-1-yl}-1-pheny-1H-pyr-azolo[3,4-d]pyrimidine)是1种EV71抑制剂,通过减少病毒 RNA的积累,抑制病毒的复制,DTriP-22对EV71的复制主要体现在对3D聚合酶活性的抑制,可能是通过阻断核苷酸进入3D聚合酶的空腔而干扰3D聚合酶的活性。不仅可以抑制3D聚合酶延伸活性,还可在病毒复制期间干扰3D聚合酶的其他功能,继而影响病毒的复制。DTriP-22对其他类型的肠道病毒也具有很强的抗病毒活性,对HSV-1和HSV-2两种病毒却无抑制性[33]。

黄芩苷Baicalin是从黄芩根中提取的1种黄酮类化合物,用黄芩苷(50μg/ml)处理EV71感染的细胞,结果显示3D的mRNA水平明显地受到抑制,而VP1、2A和3C的mRNA水平完全不受影响,由此可见黄芩苷可在EV71复制的早期阶段通过干扰3D聚合酶转录和翻译对EV71感染表现出有效的抗病毒作用[34]。以上3种化合物均可在不同程度上抑制3D蛋白的活性,这种抑制性可为针对3D蛋白靶点的抗病毒药物的研制提供思路。

5 展望

据报道,我国每年由EV71感染所致的重症和轻症HFMD所耗费用高达十几亿元[35]。目前没有能够有效治疗HFMD的特异性药物,主要还是感染后的对症治疗。我国现有3家疫苗企业生产的EV71疫苗已获国家相关部门批准上市,目前为止国外还没有上市此类疫苗。近几年有关肠道病毒与自噬的研究较多,有研究表明EV71病毒中的一些非结构蛋白可通过促进自噬体的积累促进自身复制[36],3D蛋白与病毒自噬的关系尚不十分明确,如上文中所提及的3D蛋白可通过作用于PI3K/AKT/m TOR信号通路促进病毒复制,而此通路与细胞自噬密切相关,3D蛋白是否通过作用于自噬促进病毒复制尚需进一步实验验证。3D蛋白在EV71感染过程中发挥重要作用,可促进病毒复制、激活炎性反应、减弱干扰素的抗病毒活性等等。尽管目前已经发现了3D蛋白的一些功能,但缺乏对此蛋白的全面的认识。还需针对3D蛋白的结构和功能开展进一步的研究,这将有助于寻找EV71病毒的毒力位点并阐明EV71的致病机制,也为新型疫苗及相关的抗病毒药物的研制提供新的思路。

利益冲突无