柚皮素对人肺鳞癌NCI—H2170细胞增殖、凋亡的影响

曾德贵 陈保安 吴尚 黄慧 伍俊

[摘要] 目的 探討柚皮素对人肺鳞癌细胞NCI-H2170的增殖、凋亡及细胞周期的影响。 方法 用MTT法检测柚皮素对NCI-H2170细胞增殖的影响，Hoechst33258/PI染色检测NCI-H2170细胞形态学变化，流式细胞术（FCM）检测细胞周期的改变。Western blot检测柚皮素处理NCI-H2170细胞24 h后PARP、Bcl-2、Bid、procaspase-3及procaspase-8蛋白的表达。 结果 柚皮素处理人肺鳞癌NCI-H2170细胞24 h后，浓度依赖性地抑制NCI-H2170细胞增殖；其中12.5 μmol/L处理组与对照组比较，差异无统计学（P > 0.05）；25、50、100 μmol/L处理组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。流式细胞仪分析结果显示：不同浓度的柚皮素处理NCI-H2170细胞24 h后，与对照组比较，12.5 μmol/L处理组差异无统计学意义（P > 0.05）；25、50、100 μmol/L处理组G1期细胞显著增多，S期及G2期细胞显著减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。25、50、100 μmol/L处理组与对照组相比，柚皮素上调Bid表达，促进PARP降解，Bcl-2、procaspase-3和procaspase-8降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 柚皮素抑制人肺鳞癌NCI-H2170细胞增殖，并能诱导NCI-H2170细胞产生G1期阻滞，诱导细胞凋亡。

[关键词] 柚皮素；人肺鳞癌NCI-H2170细胞；细胞凋亡；增殖；细胞周期

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（b）-0004-05

Effects of Naringenin on the proliferation and apoptosis of lung cancer cell NCI-H2170

ZENG Degui1* CHEN Bao′an2* WU Shang3 HUANG Hui3 WU jun1，2

1.Department of Pharmacy， Shenzhen Center for Chronic Disease Prevention and Control， Guangdong Province， Shenzhen 518020， China； 2.Institute of Respiratory Diseases， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang 524023， China； 3.Department of Biochemistry and Molecular Biology， Guangdong Medical University， Zhanjiang ， Guangdong 524023， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Naringenin on the proliferation， apoptosis and cell cycle of human lung squamous cell carcinoma cell line NCI-H2170. Methods The proliferation of NCI-H2170 cells was detected by MTT assay. The morphological changes of NCI-H2170 cells were detected by Hoechst33258/PI staining. Cell cycle changes were measured by flow cytometry （FCM）. Western blot was used to detect the expression of PARP， Bid， Bcl-2， procaspase-3 and procaspase-8 in NCI-H2170 cells treated with naringenin. Results The proliferation of human lung squamous cell carcinoma NCI-H2170 cells were inhibited in a dose-dependent manner after treating with Naringenin for 24 h. It was not significant difference between 12.5 μmol/L treatment group and the control group （P > 0.05）.However， 25， 50， 100 μmol/L treatment groups were significantly different comparing to the control group （P < 0.05）. The results of flow cytometry analysis showed that it was not significant difference between 12.5 μmol/L treatment group and the control group （P > 0.05）. However， after NCI-H2170 cells were treated with 25， 50， 100 μmol/L naringenins， the number of cells had significantly increased in G1 phase， desceased in S phase and G2 phase， comparing to the control group （P < 0.05）. Naringenin up-regulated Bid expression， promoted the degradation of PARP and the decrease of Bcl-2， proaspase-3 and proaspase-8 in NCI-H2170 cells， comparing to the control group （P < 0.05）. Conclusion Naringenin inhibits the proliferation of human lung squamous cell carcinoma cell line NCI-H2170 and induces the G1 phase arrest in NCI-H2170 cells and induces cell apoptosis.

[Key words] Naringenin； Human lung cancer cell line NCI-H2170； Apoptosis； Proliferation； Cell cycle

肺鳞癌占原发性肺癌的40%～51%，肺鳞癌与吸烟有密切关系，严重危害人体健康和生命[1]。目前针对肺鳞癌治疗方法有手术、放疗、化疗治疗等。手术、放疗、化疗的毒副作用对人体的巨大伤害，使机体自身的抗病能力大大降低，容易引起肿瘤细胞的恶性转移[2]，所以筛选效果佳，低毒的抑癌药物特别重要。从天然药物中筛选治疗肺鳞癌是目前药物研发方向之一。柚皮素是一种天然黄酮类化合物，其广泛存在于柠檬、葡萄汁、橘子等中，具有多种生物学活性和药理作用[3-4]。Park等[5]研究提示，柚皮素抑制胰腺癌过氧化物氧还蛋白-1（Peroxiredoxin-1，Prdx-1）的表达，促进凋亡信号调节激酶1（ASK1）的上调，诱导ROS大量产生介导胰腺癌细胞凋亡。柚皮素通过干预PI3K/AKT信号通路诱导前列腺癌细胞凋亡[6]；抑制乳腺癌细胞分泌TGF-β1，并减弱PKC活性阻止乳腺癌肺转移[7]。本研究拟从柚皮素影响肺鳞癌细胞的增殖、阻滞细胞周期和关键凋亡蛋白表达变化方面进行研究，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NCI-H2170细胞株以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于37℃，5%CO2中培养。RPMI1640（Gibco公司，批号：C11875500BT）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：20160718）；Western blot luminol reagent（北京中杉金桥生物有限公司）；兔抗山羊IgG-HRP，山羊抗鼠IgG-HRP，山羊抗人Bid（sc-6538），procaspase-3（sc-1225），procaspase-8（sc-73526）和PARP（sc-1561）抗体（均为Santa Cruz公司产品）。Hoechst33258/PI染色溶液（江苏碧云天，批号：40730ES10）和PI（上海源叶生物科技有限公司，批号：S19136）。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法检测细胞生长增殖情况 取处于对数生长状态的NCI-H2170细胞，胰酶消化分散细胞，计数，按照每孔5×103个细胞加入96孔板中，100 μL/孔，37℃，5%CO2培养24 h后，更换含不同浓度柚皮素的RPMI1640培养液，每个柚皮素浓度设5个复孔，柚皮素浓度分别为0、12.5、25、50、100 μmol/L，其中对照组柚皮素浓度是0 μmol/L。柚皮素处理24 h后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），再培养4 h后，吸弃培养液，每孔加入100 μL DMSO，混匀5～10 min，待沉淀完全溶解后，选择波长570 nm，用酶标仪测每孔OD值，按公式计算细胞存活率：细胞存活率=（加药组平均OD值/对照组平均OD值）×100%，并重复3次实验。

1.2.2 Hoechst33258/PI染色观察NCI-H2170细胞的凋亡 取处于对数生长状态的NCI-H2170细胞，用胰酶消化分散细胞，计数，将细胞浓度调整为1.0×106个/mL，向六孔板的每个孔内加入2 mL细胞悬液。静候细胞完全贴壁后（为50%～80%满），更换含不同浓度柚皮素的RPMI1640培养液，培养液含柚皮素药物分别为0、12.5、25、50、100 μmol/L，其中对照组柚皮素浓度是0 μmol/L，继续培养24 h后，向每孔胞内添加Hoechst33258/PI溶液，37℃反应10 min。用荧光显微镜在激发光350 nm，发射光在460 nm条件下观察拍照，荧光显微镜下活细胞核呈均匀弥散的蓝色荧光，凋亡细胞的细胞核呈现致密浓染的荧光颗粒。

1.2.3 用流式细胞技术分析细胞周期 加入不同柚皮素浓度（0、12.5、25、50、100 μmol/L）作用1.0×106个/mL NCI-H2170细胞后，1000 r/m，r=5 cm，离心5 min沉淀细胞。PBS漂洗后，加入预冷的70%的乙醇溶液悬浮细胞，4℃固定过夜。检测前用1000 r/m，r=5 cm，离心5 min，倒掉乙醇溶液，然后用PBS洗3次，加入0.5 mL 50 μg/mL PI染液避光染色30 min。用100目的尼龙膜过滤细胞，然后用流式细胞仪检测细胞DNA的含量，计算各周期时相细胞的百分比。

1.2.4 免疫印迹 不同浓度柚皮素（0、25、50、100 μmol/L，12.5 μmol/L与25 μmol/L效果相差不大，因而在免疫印迹分析时将12.5 μmol/L组放弃）作用1.0×106个/mL NCI-H2170细胞24 h后，收集细胞，用PBS洗涤细胞后加入细胞裂解液100 μL（50 mmol/L，pH8.0的Tris-HCl缓冲液，含150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，2 μg/mL Aprotinin，0.5 μg/mL Leupeptin，1%NP40， 0.05%PMSF），在冰上用超声波破碎细胞，10 s/次，共3次，每次间隔10 s。12 000 g，离心5 min，去细胞裂解上清液。取10 μL上清液用考玛斯亮兰G-250染色法测定各组裂解液蛋白含量，其余上清液，按1∶1体积加入2倍浓度的上样缓冲液（100 mmol/L pH6.8 Tris-HCl，4%SDS，20%甘油，10% β-巯基乙醇，0.05 mg/mL溴酚兰）。

进行电泳前煮沸样品5 min，每个电泳泳道加蛋白量为100 μg，进行SDS-PAGE电泳，然后低温环境进行电转。将转移好的NC膜在含5%（W/V）脱脂奶粉磷酸盐缓冲液中封闭液2 h。一抗加入量按0.1 mL/cm2，在室温用摇床平缓摇动反应2 h。用TBS（150 mmol/L NaCl，50 mmol/L tris-HCl，pH7.5）洗涤3次，每次15 min。按0.1 mL/cm2的量加入二抗，室温在平缓摇动的摇床反应2 h。用TBS（150 mmol/L NaCl， 50 mmol/L tris-HCl，pH7.5）洗涤3次，每次15 min。在暗室中，將ECL试剂的A、B液在一小平皿中等量混合，按0.13 mL/cm2的量加于NC膜上，数码成像保存。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，先用Homogeneity of Variances进行方差齐性检验，方差齐性用LSD-t检验，方差不齐用Tamhane′s T2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 柚皮素抑制NCI-H2170细胞生长

NCI-H2170细胞被不同浓度的柚皮素处理24 h后，用MTT法测定药物对细胞生长的影响，结果显示，柚皮素浓度依赖性地抑制NCI-H2170细胞增殖；其中12.5 μmol/L处理组与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；而25、50、100 μmol/L处理组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 Hoechst33258/PI荧光染色结果

在荧光显微镜下观察发现活细胞的细胞核染被均匀地染成淡蓝色荧光，而凋亡细胞的胞核呈现出亮蓝色，有的核呈分叶状凝聚。细胞经柚皮素处理后，对照组细胞核染被染成均一的淡蓝色，12.5 μmol/L处理组细胞核大多染为淡蓝色，出现少数亮蓝色染色，这种现象在25 μmol/L处理组中进一步增加。50 μmol/L处理组细胞数目较少，细胞核大多呈现出典型的凋亡核形态的特征：蓝色荧光增强，细胞核压缩碎裂成大小不一的不规则块状、圆形或花瓣状。柚皮素100 μmol/L处理组细胞减少，亮蓝色体积偏小的凋亡小体的比率增加。见图2（封四）。

2.3 柚皮素作用24 h对NCI-H2170细胞周期的影响

NCI-H2170细胞被不同浓度的柚皮素处理24 h后，收集各组细胞用流式细胞仪检测。与对照组相比，12.5 μmol/L处理组差异无统计学意义（P > 0.05）；25、50、100 μmol/L处理组G1期细胞增多，S期及G2期细胞减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 Western blot检测分析凋亡相关蛋白表达

25、50、100 μmol/L处理组与对照组相比较，柚皮素上调Bid蛋白水平，促进PARP蛋白水平下降，Bcl-2蛋白水平下降；procaspase-3和procaspase-8蛋白水平降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

3 讨论

肺鳞癌对放疗、化疗存在一定耐受性，寻找有效的副作用低的天然药物有效单体是目前研究的热点，也是实现中医药研究现代化的方向[9]。本研究选择了黄酮类化合物柚皮素，柚皮素作为一种中药成分，其来源广泛，价格低廉，具有广泛的生理及药理活性等优点，正逐渐成为医药和保健领域研究的热点。本次实验研究了柚皮素对肺鳞癌NCI-H2170细胞生长、细胞凋亡及细胞周期等方面的影响。

细胞增殖和细胞凋亡受细胞内稳态系统的调节，细胞生长有赖于细胞增殖和细胞凋亡的平衡。研究抗癌物质对细胞增殖的影响常常是验证其抗癌有效性的一种重要手段[8]。中药毒副作用小，也可减轻放化疗引起的毒副作用，增强放化疗的敏感性[9]。本研究结果提示柚皮素抑制肺鳞癌细胞增殖生长，抑制效果与柚皮素的浓度相关。用荧光染料染色观察发现，柚皮素诱导肺鳞癌细胞凋亡，这与Banjerdpongchai等[10]在肝癌中的研究结果类似，提示柚皮素通过诱导肺鳞癌细胞凋亡抑制了细胞增殖。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，通常被分为四期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。增殖细胞的染色体在S 期复制，经过G2期后，细胞开始有丝分裂的复杂过程。肿瘤呈快速生长状态，一般S期细胞比例比正常生长细胞高。碘化丙啶（PI）与DNA紧密结合，用流式细胞术检测细胞结合PI荧光强度和数量可检测分析细胞周期分布情况。本研究结果提示，柚皮素可以使NCI-H2170细胞G1期比例增加，S期及G2期比例减少，说明柚皮素作用NCI-H2170细胞24 h，抑制了肺鳞癌DNA复制，使细胞周期阻滞于G1期，抑制细胞快速增殖[11]。许多肿瘤的发生与细胞周期的失控有关，对细胞周期进行干预也是目前肿瘤治疗的一个方向[12-13]。

细胞凋亡的机制十分复杂，Caspase家族与细胞凋亡关系密切[14-15]。它们均以无活性的前体存在于细胞中，一经激活，将产生Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。Bid属于促凋亡BH3-only亚家族，Bid表达水平增加可拮抗Bcl-2的作用，并促进细胞凋亡[16-18]。本研究发现柚皮素作用于肺癌NCI-H2170细胞后，Bid表达上调，Bcl-2表达下调；同时发现柚皮素诱导procaspase-3、procaspase-8水平下降，表明procaspase-3、procaspase-8激活[15]。可见Bid、Caspase-3、Caspase-8参与了柚皮素诱导肺癌NCI-H2170细胞凋亡的过程。

PARP广泛存在于真核细胞核内，具有蛋白质修饰和核苷酸聚合作用，参与染色质解聚，DNA复制及修复。细胞内含有丰富的完整的PARP可抵抗化疗药物对细胞的损伤。如果PARP被切割降解失活，则会使得细胞丧失DNA损伤修复的功能促进细胞凋亡[14-15]。在本研究中，柚皮素处理NCI-H2170细胞24 h后，PARP蛋白表达量下降，切割增加。可见柚皮素可促进PARP切割降解，使肺鳞癌细胞不能及时修复受损的DNA，抑制DNA复制。最终促进肺鳞癌细胞凋亡。

研究表明柚皮素对肺鳞癌NCI-H2170细胞生长凋亡的调控与Bid、Caspase-3、Caspase-8和PARP蛋白参与的信号途径有关。笔者将进一步深入展开研究柚皮素和顺铂是否具有协同作用抑制肺鳞癌的生长，并进一步研究柚皮素的分子药理机制。

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（收稿日期：2018-01-10 本文編辑：李岳泽）