慢传输型便秘大鼠结肠Cajal间质细胞自噬现象的发生及钙离子水平的定性分析

田宇 毛於安

[摘要] 目的 探討慢传输型便秘（STC）大鼠结肠Cajal间质细胞（ICCs）自噬现象的发生情况，并定性分析其钙离子浓度水平的变化。 方法 选用SPF级健康Wistar雄性大鼠40只，按照随机数字表法分为对照组（n=20，正常大鼠）和模型组（n=20，造模大鼠）。采用复方苯乙哌啶制备STC大鼠模型，记录大鼠粪便粒数、每粒粪便质量、大鼠体重及首粒黑便排出时间的变化，判定模型成功建立与否。免疫荧光检测两组大鼠结肠ICCs形态变化，透射电镜检测结肠ICCs自噬情况，免疫荧光法测定ICCs中的钙离子浓度。 结果 对照组大鼠试验期间均生长良好，模型组1例死亡。模型组大鼠日均粪便粒数及造模第30天模型组平均体质量较对照组明显减少（P < 0.05），平均每粒粪便质量较对照组升高（P < 0.05），首次排黑便时间较对照组明显延长（P < 0.05）。对照组大鼠结肠组织中的ICCs细胞相互交织相连形成了密集且精密的网状结构，存在条形分支。模型组大鼠肠道内ICCs细胞数量明显减少，ICCs交互网络稀薄，细胞变窄变细。与对照组比较，模型组中ICCs细胞自噬泡数量上升且表现出明显细胞自噬性死亡。对照组大鼠中ICCs细胞胞体平滑且细胞分叉，细胞间连接成网络结构。STC大鼠ICCs中荧光斑点数量及荧光强度与对照组比较，明显升高。 结论 STC大鼠肠道内ICCs的数量减少是发生了细胞自噬现象。STC大鼠模型中ICCs细胞内游离Ca2+升高，Ca2+升高可能是导致ICCs自噬性死亡的原因。

[关键词] 慢传输型便秘；结肠Cajal间质细胞；自噬现象；大鼠；钙离子浓度

[中图分类号] R574 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（b）-0020-04

Autophagy of Cajal mesenchymal cells in the colon Cajal in rats with slow transit constipation and the qualitative analysis of calcium ion level

TIAN Yu MAO Yu′an

Department of Digestive Medicine， the Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830002， China

[Abstract] Objective To investigate the autophagy of Cajal mesenchymal cells in the colon Cajal in rats with slow transit constipation， and qualitatively analyze the calcium ion level. Methods Forty healthy Wistar male rats were divided into control group （n=20， normal rats） and model group （n=20， model rats） by random number table. Compound phenylethylpiperidine was used for preparation on STC rat model， grain number， every grain of waste quality， body quality of rats， the first grain of black were recorded to judge the model successfully established or not. Colon ICCs of rats in two groups were detected bydetection of immunofluorescence assay， and the concentration of calcium ions in ICCs was determined by immunofluorescence assay. Results The control group had good growth during the experiment， and one died in the model group. Daily waste grain number， average body quality after 30 days in model group were less than those in the control group（P < 0.01）， the average grain of feces quality was higher than that in the control group （P < 0.05）， and the first row of black time was obviously prolonged in the control group （P < 0.05）. The rats colon tissue of ICCs in control group were intertwined to form the intensive and precision of the mesh structure， they had obvious cell branch. The number of ICCs in the intestinal tract of the model group was significantly reduced， and the ICCs was thin and the cell shape narrowed. Compared with the control group， the autophagy number of ICCs in the model group increased and showed the apparent autophagy death. In the control group， ICCs were smooth and had multiple directional and irregular cell branches， and intercellular interaction was connected to the network structure. The number of fluorescence spots and fluorescence intensity in the ICCs of STC rats were significantly higher than those in the control group. Conclusion The number of ICCs in STC rats is reduced and autophagy is occurred. In the STC rat model， the free Ca2+ ions in the ICCs cells are elevated， and the increasing of Ca2+ ion may be the cause of the ICCs′ autophagy death.

[Key words] Slow transit constipation； Colon Cajal mesenchymal cells； Autophagy phenomenon； Rats； Ca2+ ion concentration

慢传输型便秘（STC）是一种涉及全胃肠道动力紊乱而引发的肠内容物在结肠近端到结直肠远端的通过时间较正常情况有所减慢而引发的疾病，STC占功能性便秘患者的45.5%左右[1-3]，且临床表现较为顽固，严重影响患者的生活质量、身心健康[4]。动物实验表明，慢传输型便秘大鼠结肠Cajal间质细胞无法正常发挥功能，通过免疫荧光检测模型及正常大鼠结肠ICCs形态变化推测可能发生自噬[5]。细胞自噬被认为是在正常情况下当细胞面对外界的异常能量代谢、营养不良等的一种自我应激反应。诱导细胞发生自噬的因素缘于细胞外，也有可能是来自细胞内的因素[6-7]。利用透射电镜检测结肠ICCs自噬现象，并用钙离子水平的定性分析来进一步验证，目前较少有此思路的研究。因此，本研究采用药物造模法，明确STC中ICCs功能异常的原因，为利用STC的发病机制来指导临床治疗提供价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar健康大鼠40只，雄性，SPF级，8周龄，体重（120±10）g，由我院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK-（冀）2007-004，实验动物合格证号：1131800645；按随机数字表法分为对照组（n=20）和模型组（n=20）。室温下适应性饲养1周（室温18～24℃，相对湿度50%～70%，每天光照10～12 h，自由饮水）。

1.2 试剂与仪器

复方苯乙哌啶，由河南中孚药业有限公司生产，批号：20170911，产品规格：2.5 mg（盐酸地芬诺酯）-25 μg（硫酸阿托品）；活性炭悬液（100 g/L），粉末活性炭（分析纯）；c-kit兔抗鼠多克隆抗体（Sigma公司，美国）；DAB显色试剂盒、3%过氧化氢溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

CX22生物显微镜（日本奥林巴斯）；RM2235组织切片机（德国徕卡）等。

1.3 STC大鼠模型的建立及鉴定

1.3.1 STC大鼠模型的建立 大鼠分笼适应性饲养3 d后建模，模型组大鼠予含复方苯乙哌啶的混悬液灌胃，剂量8 mg/（kg·d），对照组灌胃同体积的生理盐水。饲养时间为30 d，饮水不限。

1.3.2 STC大鼠模型的鉴定 采用首粒黑便排出时间来评价肠道传输功能，进而判定模型成功与否。取100 g阿拉伯树胶放入烧杯中，加入双蒸纯水至800 mL，煮沸，肉眼观察呈透明状后停止加热，再加入40 g纯净的活性炭煮至透明，4℃保存备用。末次复方苯乙哌啶灌胃大鼠，后将其全部禁食不禁水8 h。禁食结束分别对两组大鼠灌入5 mL上述备用悬液。以灌胃结束为起始点计时。统计每组大鼠粪便粒数、粪便质量、第7天及第30天体质量、第1次排出黑便的时间。

1.4 观察指标

1.4.1 免疫荧光检测大鼠结肠ICCs变化 3%戊巴比妥麻醉两组大鼠后处死，剪开腹腔，并常温0.01 mol/L PBS清洗其内腔以维持内腔的湿润。用小剪在整段肠道距盲部肠3～5 cm处取整段结肠，用细线结扎一端，另一段灌注4%多聚甲醛并保持溶液充盈，后将结肠另一端扎紧，固定液中固定8～12 h，分层铺片，0.01 mol/L PBS漂洗，解剖显微镜下展开上述标本并沿肠系膜的边缘缓慢剪开，剥离肠道内部及周围黏膜，取出黏膜下环行平滑肌层及纵行平滑肌，剪成标本块并放入0.01 mol/L PBS漂洗，1%BSA孵育0.5 h，继续0.01 mol/L PBS漂洗样本，后滴加0.2% BSA+0.02 mol/L PBS配制的一抗（大鼠抗小鼠的c-Kit抗体，1∶100），室温放置2 h后4℃孵育48 h。滴加0.2% BSA/0.01 mol/L PBS稀釋二抗兔抗大鼠抗体（1∶1000），室温避光孵育90 min。漂洗、复染、封片，暗处常温保存。显微镜下观察，免疫荧光染色铺片每只动物3张。对照组以对照物大鼠血清进行相同的实验操作。

1.4.2 透射电子显微镜检测结肠ICCs变化 取部分结肠组织0.9% Nacl冲洗，切成小块，固定液固定24 h。后用0.1 mol/L PBS漂洗5min，洗3次。于1%锇酸0.1 mol/L的PBS溶液中避光固定2 h。双蒸水漂洗，每次5 min，共计3次。并于饱和醋酸铀水溶液中室温避光染色处理1～2 h，乙醇溶液梯度洗脱（50%、70%、80%、90%、100%），每次10 min。100%乙醇+66%环氧丙烷混合液及100%环氧丙烷分别处理10min，1∶1和1∶4的环氧丙烷与包埋剂浸标本分别40 min及3 h，37℃过夜12 h。解剖显微镜下削去包埋剂，露出组织标本。玻璃刀切片，厚度0.2 μm左右。将切片置于载玻片上，滴加双蒸水，至90℃。1%甲苯胺兰染色，透射电子显微镜（TEM）观察大鼠结肠组织中ICCs形态变化，并统计细胞内自噬体数量。

1.4.3 免疫荧光法检测STC大鼠ICCs中的钙离子浓度 依次剥离大鼠结肠段内黏膜以及黏膜下层，注意保留结肠肌肉层，无钙PBS缓冲液反复冲洗，1200 r/min，r=0.5 μm，离心10 min弃上清，150目分子筛过滤，滤液加入0.25% NaCl 5 mL混匀，立即加入3mL 2% NaCl，混匀后1500 r/min，r=0.5 μm，离心3 min，弃上清，反复3次，收集细胞悬浮，调整浓度为5×105/mL。恒温细胞培养箱中孵育0.5 h，500 r/min离心5 min，弃上清。纯无钙缓冲液反复洗涤后稀释到1 mL。480 nm波长下观察细胞荧光强度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般状况的变化比较

对照组大鼠试验期间均生长良好，模型组1例在造模后第3天死亡。模型组大鼠日均粪便粒数比对照组明显缩小（P < 0.05）；平均每粒粪便质量较对照组明显增大（P < 0.05）；造模第7天两组的平均体重差异无统计学意义（P > 0.05），而造模第30天模型组较对照组明显降低（P < 0.05）；首次排黑便时间较对照组明显延长（P < 0.05）。见表1。

2.2 免疫荧光检测两组大鼠结肠中ICCs形态变化

ICCs胞质和突起为棕黄色，且在黏膜下层、肌间层、内环层及外纵层均有分布，其中肌间层区域最为显著，邻近的ICCs间突起可相互连接，围绕肌间神经节形成团状结构。其中对照组大鼠结肠组织中的ICCs细胞相互交织成密集的网状结构，呈现明显的细胞多极性，细胞条形分支。造模成功后的STC大鼠肠道内ICCs细胞数量明显减少，虽形成网络状，但能明显观察到ICCs交互稀薄，细胞形状窄细。见图1（封四）。

2.3 TEM检测ICCs自噬情况

与对照组比较，模型组中ICCs细胞自噬泡数量增大，提示模型组动物ICCs出现了明显的细胞自噬现象，且细胞形态变化剧烈，基质膜破解。对照组ICCs细胞胞体平滑且具有多个方向无规则状的细胞分叉，细胞胞核突起细长且含有数个不同方向及类型的突触小泡，细胞间交互相互连接成网络结构，胞质内有相对较多的内质网以及成熟的膨大高尔基体、线粒体等。见图2。

2.4 免疫荧光法检测STC大鼠ICCs中的钙离子浓度

结果显示，模型组大鼠ICCs中荧光斑点数量及荧光强度高于对照组。见图3（封四）。

3 讨论

STC的发病因素较多，机制较为复杂，其肠道功能紊乱涉及从食管到肛门的含黏膜的消化系统。该病是一种因结肠传输功能物滞留于结肠而引发的顽固性便秘。随着便秘发生率的不断攀升，越来越多的实验开始对STC的发病机制进行研究，其中针对STC胃肠道动力障碍方面的机制研究较多，但对于自噬现象的发生影响尚无定论。

细胞自噬是在正常情况下细胞面对外界的不正常能量代谢，营养缺乏、代谢压力等表现出的一种自我应激反应[7-8]。通常情况下，诱导细胞发生自噬是细胞内外共同作用的结果[9-12]。Goodall等[13]发现细胞自噬可提高黑色素瘤肿瘤细胞的凋亡速率，加速促使了凋亡功能缺失的肿瘤细胞产生了自噬性的细胞“凋亡”。本研究为更好地阐明STC大鼠结肠ICC细胞的自噬现象发生的机制，采用复方苯乙哌啶制备模型，由于其为非特异性止泻药，能够直接在肠平滑肌内发挥功效，通过降低肠载膜感受器功能来阻止局部载膜的蠕动反射反应，削弱肠蠕动活动，延迟肠内容物排泄[14-15]，制备因肠蠕动抑制而致的STC。由于这种便秘模型与临床上STC的病理生理过程较为相似，也为本研究奠定了一定的模型基础。

本研究结果显示，通过免疫荧光法检测肠道内ICCs的表达变化情况以及TEM检测慢性传输型大鼠肠道组织中ICCs细胞自噬泡，可见STC动物肠内ICCs出现自噬性细胞死亡。文献报道，人体肠腔的ICCs电子活动与ICCs中Ca2+浓度呈动态相关，Ca2+利用细胞内磷脂酰肌醇3-激酶（IP3-Kinase）的调控，在细胞质内形成内流，部分Ca2+还能在线粒体内产生电活动[16-21]。本研究观察样本组织中ICCs细胞自噬泡现象，表明STC大鼠ICCs的细胞胞浆内出现了的大量的自噬泡以及自噬溶酶体降解后残余的细胞器（如线粒体）等。为进一步检测ICCs内发生的细胞自噬是否与ICCs细胞内Ca2+浓度超载存在一定的关系，本文又采用免疫荧光来检测人体肠道肌群ICCs中游离的Ca2+水平变化，结果示STC大鼠肠道内ICCs胞浆内的游离Ca2+浓度增加。可见当外界刺激或者穩态不再平衡等情况发生时，会出现ICCs细胞内Ca2+耗竭，进而激活钙通道，大量细胞外钙离子内流，出现Ca2+超载，最终导致ICCs自噬性凋亡，引发STC。

综上所述，本研究的实验结果表明STC大鼠肠道内ICC的数量减少是发生了细胞自噬现象。STC大鼠模型中ICC细胞内游离Ca2+升高，Ca2+升高可能是导致ICC自噬性死亡的原因。本研究对于下一步研发针对ICCs的新型药物或者诊疗手段具有较强的临床指导意义和应用价值。

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（收稿日期：2017-12-06 本文編辑：李岳泽）