苯并(a)芘对细胞模型影响的初步研究

◎ 肖路遥，陈家辉，印晓玉，薛淑楠，刘 延，蒋栋磊

（扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127）

随着食品工业的不断发展，食品污染引起的疾病逐渐增多[1]。其中，多环芳烃（PAHs）的污染尤为严重。PAHs是一种稠合芳香环烃化合物，具有致癌潜力。许多研究已经证明[2-4]，肺癌、心脏病发病率的增加都与PAHs有关系。BaP往往在加工过程中产生，食品本身很少含有这种物质[5-6]。BaP被人体摄入后，被肠道吸收，最后通过血液循环遍布全身，对人体产生危害[7]。研究表明[8-9]，BaP具有强烈的致癌性、致病性，包括改变DNA甲基化、改变组蛋白乙酰化、引起细胞周期紊乱和信号转导等。本文以BaP为研究对象，通过检测细胞Ca2+水平和活性变化，筛选出对于识别BaP更敏感的细胞株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

PC-12神经细胞、RAW 264.7巨噬细胞、RBL-2H3肥大细胞：中科院上海细胞库；苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene，BaP]：上海阿拉丁生化技术有限公司；Fluo-4 AM 5 mM、MTT细胞毒性及增殖检测试剂盒：碧云天生物技术有限公司；酶标仪、倒置荧光显微镜：美国Thermo Fisher电子公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT实验

加入100 μL重悬细胞于96孔板中，每孔约5 000个细胞，37 ℃培养过夜，使细胞完全贴壁。依次加入10 μL浓度为10～50 μmol/L的BaP，不加BaP的细胞为空白对照。每孔依次加入10 μL MTT溶液，37 ℃继续孵育。孵育结束后，依次加入100 μL Formazan溶解液，继续孵育。光学显微镜下观察紫色Formazan结晶是否全部溶解。用酶标仪在570 nm处测定吸光度。细胞活力（cell viability）的公式如下：

式中，A（加药）为添加BaP刺激的细胞孔板的OD值；A（调零）为没有细胞和BaP孔板的OD值；A（空白对照）为没有BaP刺激细胞孔板的OD值。

1.2.2 Ca2+荧光

加入100 μL重悬细胞于96孔板中，37 ℃培养使细胞完全贴壁，用PBS分别清洗细胞3次以防止培养液降解Fluo-4 AM。稀释Fluo-4 AM母液到浓度为1 μmol/L，加入孔板后孵育30 min以完成荧光探针的装载。装载完成后，用PBS洗涤细胞2～3次，37 ℃再次孵育30 min，使Fluo-4 AM转变成Fluo-4。依次加入10 μL浓度为10～50 μmol/L的BaP，将不加BaP刺激的细胞作为空白对照，37 ℃下孵育12 h。用倒置荧光显微镜拍摄钙离子荧光图，酶标仪用来测定荧光强度，设定的激发波长为460 nm，发射波长为520 nm。不同浓度BaP刺激后的荧光强度与该细胞空白对照的比值（F/F0）为相对荧光强度，用来表示对应的Ca2+浓度。

2 结果与分析

2.1 BaP对不同细胞活力影响的探究

图1表明，不同浓度的BaP均能不同程度的抑制3种细胞的活力。BaP的浓度为50 μmol/L时，对3种细胞的抑制作用最强。与空白对照组相比，3种细胞的活力分别降低29.72%、15.81%和19.66%。BaP浓度为10 μmol/L时，3种细胞活力的抑制作用较小，此时对PC-12细胞活力的抑制最明显，为18.7%。结果表明，BaP对PC-12细胞活力的抑制效果更强，且在一定范围内，BaP的浓度越高，抑制效果越明显。

图1 BaP对PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3细胞活力的影响图

2.2 BaP对不同细胞内Ca2+浓度的影响

细胞内Ca2+浓度的变化与细胞凋亡有着紧密的联系[10]。图2中，A、C、E为不添加BaP的对照组；B、D、F为10 μmol/L BaP处理后的PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3细胞。3种细胞在10 μmol/L的BaP处理后均出现明显的荧光点。相比于其他两种细胞，PC-12细胞的荧光更为强烈。实验表明，3种细胞的Ca2+浓度在BaP处理后均升高，PC-12细胞的Ca2+浓度变化更为明显。

图2 BaP对PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3细胞内Ca2+水平的影响图

图3表明，不同浓度的BaP均能显著改变胞内Ca2+的浓度。PC-12荧光强度的变化更为强烈，抑制作用更明显。已有相关的研究表明，BaP能影响胞内钙离子浓度的变化，进而诱导细胞凋亡[11]。运用SPSS对3种细胞的细胞活力与荧光强度之间的相关性进行分析，得出PC-12细胞的两者相关系数为-0.880 7，RAW 264.7细胞为-0.413 1，而RBL-2H3细胞为-0.669 2，所以PC-12细胞更敏感。

图3 BaP对PC-12、RAW 264.7和RBL-2H3细胞内Ca2+水平的影响图

3 结论

结果表明，PC-12神经细胞活力与Ca2+浓度变化之间的相关性更高，说明PC-12神经细胞对于BaP更灵敏。为今后对于BaP在细胞方向上的研究奠定了基础。

参考文献：

[1]陈锡文，邓 楠，韩 俊，等.中国食品安全战略研究[M].北京：化学工业出版社，2004.

[2]Zhou Z， Yang X， Jin L， et al. Quantitative structureactivity forecast of the PAHs toxicity by using the supporting vector machine[J]. Journal of Safety & Environment，2017.

[3]Agudelocastañeda D M， Teixeira E C， Schneider I L， et al. Exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons in atmospheric PM1.0 of urban environments: Carcinogenic and mutagenic respiratory health risk by age groups[J].Environmental Pollution，2017，224：158-170.

[4]Ofomatah A C， Okoye C. Contamination levels， toxicity profiles， and emission sources of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in the soils of an emerging industrial town and its environs in the Southeastern Nigeria.[J]. Environmental Monitoring & Assessment，2017，189（12）：623.

[5]史巧巧，席 俊，陆启玉.食品中苯并芘的研究进展[J].食品工业科技，2014，35（5）：379-381.

[6]黄超群，付馨慰，楼成杰，等.植物油中苯并(a)芘残留标准样品的研制[J].理化检验-化学分册，2015，51（6）：862-864.

[7]杨兆静.活性炭对焦化废水中苯并[a]芘的去除工艺研究[D].临汾：山西师范大学，2013.

[8]Yuan L，Liu J，Deng H，et al. Benzo[a]pyrene induces autophagic and pyroptotic death simultaneously in HL-7702 human normal liver cells[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry，2017.

[9]Bak Y，Jang H J，Seo J H，et al. Benzo[a]pyrene alters the expression of genes in A549 lung cancer cells and cancer stem cells[J]. J Microbiol Biotechnol，2018.

[10]Liu L，Chang X，Zhang Y，et al. Fluorochloridone induces primary cultured Sertoli cells apoptosis: Involvement of ROS and intracellular calcium ions-mediated ERK1/2 activation.[J].Toxicology in Vitro，2017，47：228-237.

[11]Lian L F，Chen Y Q，Hou H Y，et al. Effect of Kaempferol on the BaP Induced Apoptosis in Human Chorionic Trophoblast Cells HTR8/SV neo[J]. Journal of International Obstetrics & Gynecology，2014.