瓜蒌皮提取物对同型半胱氨酸诱导动脉粥样硬化的保护作用

甄庆强，张洁，雷震，李猛

(1.莱芜市人民医院 血管外科, 山东 莱芜 271100;2.郑州市第八人民医院 药械科, 河南 郑州 450045;3.河南省中医院中心实验室, 河南 郑州 450045)

瓜蒌，葫芦科植物，是一种常见的中药，性寒、味甘、微苦。主治肺热咳嗽，痰浊黄稠，胸痹心痛，结胸痞满。果实剖开，除去种子和瓜瓤，剩余部分称为瓜蒌皮。《中药志》记载瓜蒌皮：“涤痰结，舒肝郁。治痰热咳嗽，胸胁作痛”[1]。动脉粥样硬化是目前发病率较高的心血管疾病，是冠心病、脑梗死、心肌梗死等的主要病因[2]，如何控制和治疗动脉粥样硬化是近几年研究的热点。除高血压、高血脂、糖尿病、年龄等引起动脉粥样硬化的传统因素之外，高同型半胱氨酸血症是导致动脉粥样硬化的独立危险因素之一[3]，同型半胱氨酸可通过多种途径影响动脉粥样硬化的发生发展，作者主要是研究瓜蒌皮提取物如何影响同型半胱氨酸诱导的动脉粥样硬化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MTT试剂、同型半胱氨酸购自Sigma公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，RT- PCR 试剂盒购自TaKaRa公司，DMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司。苏木素伊红HE染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司，瓜蒌皮提取物国药准字Z20027540，购自上海第一生化药业有限公司。

1.2 实验仪器

智能型全自动生化分析仪，意大利Crony公司；ABI97OO扩增仪，美国应用生物系统公司；ELx800光吸收酶标仪，美国Biotek公司；X- ZOZB 轮转式病理切片机，上海华岩仪器设备有限公司；智能型全自动生化分析仪，意大利Crony 公司；TG16- 微量高速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司；TEC- 2800病理包埋机，意大利 Histo- line 公司。

1.3 动物来源、分组及建模

60只Wistar健康大鼠，雌雄不限，7周龄，体重180～200 g，购于北京生命科学研究所，在温度23～25 ℃、相对湿度40%～60%、光照12 h的SPF级动物实验室饲养，自由进食及进水。将60只Wistar大鼠随机分为3组：对照组20只、同型半胱氨酸(Hcy)模型组20只、瓜蒌皮提取物实验组20只。正常对照组给予基础饲料喂养；Hcy模型组在基础饲料中加入质量分数为1%的蛋氨酸；瓜蒌皮提取物实验组在1%蛋氨酸饮食同时用瓜蒌皮提取物(2 g·ml-1)按照15 ml·kg-1的量每日灌胃1次，试验周期为11周[4]。在第11周末给予各组大鼠禁食12 h处理，0.1%的戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉后于大鼠颈动脉处取血液3 ml，然后室温静置约0.5 h，3 000 r·min-1离心15 min，取血清后置于-70 ℃环境下保存待检测。

1.4 血管平滑肌细胞的分离培养

取血液样本同时取3组各自Wistar大鼠的胸主动脉，根据组织贴块法[5]分离培养血管平滑肌细胞。分离的原代细胞用15%FCS的DMEM培养，细胞传代后用10%FCS的DMEM培养，实验用第3～8代细胞。

1.5 细胞增殖实验

采用MTT比色试验检测血管平滑肌细胞增殖，细胞分别在培养至第1、2、3、4、5天时弃去培养液，用PBS洗2次，每孔加无血清培养基100 μl和5 g·L-1MTT 10 μl培养2 h，每孔吸取80 μl培养液，加DMSO 100 μl，转入EP管，用DMSO稀释至310 μl，立即在ELx800光吸收酶标仪吸收波长490 nm下读取吸光度值，每组重复测6次(n=6)。

1.6 RT- PCR法检测细胞中c- myc及c- fos mRNA表达

各组细胞处理24 h后用Trizol试剂提取细胞中RNA,用紫外分光分析和凝胶电泳检测所提取总RNA 的质量和浓度。在逆转录酶(MLV)催化下合成 cDNA，并进行PCR 扩增。根据人c- myc、c- fos和β- actin基因的c- DNA序列，按照引物设计原则用 Primer 5.0 引物设计软件设计引物。 β- actin的上游引物序列为5′- GCC ATG TAC GTA GCC ATC GA- 3′，下游引物序列为5′- GAACCGCTCATTGCCGATAG- 3′；c- myc的上游引物序列为5′- AAACCTCCTCACAGCCCACT- 3′，下游引物序列为5′- TCCAAGACGTTGTGTGTTCG- 3′；c- fos的上游引物序列为5′- TGGACCTGTCTGGTTCCTTC- 3′，下游引物序列为5′- TGTTTAAGCTGTGCCACCTG- 3′。PCR 反应体系25 μl，10×Buffer 2.5 μl，探针 probe 1.5 μl，dNTP 0.5 μl，H2O 20 μl，Taq 0.5 μl，进行PCR反应；反应程序为：95 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，70 ℃ 8 min，4 ℃保存1 h。

1.7 主动脉组织切片的制作

各组大鼠处死后取胸主动脉常规甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，片厚3～5 μm，HE染色切片，操作步骤按照试剂盒说明书进行，在显微镜(×400)下观察主动脉斑块情况。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 血清学指标

对照组和瓜蒌皮提取物实验组血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、Hcy显著低于Hcy模型组，P<0.05，差异有统计学意义。而对照组与瓜蒌皮提取物实验组血清TC、TG、LDL、Hcy差异无统计学意义。见表1。

2.2 胸主动脉组织病理切片

主动脉组织病理切片用HE染色，对照组主动脉组织内膜完整光滑，形态正常，中膜平滑肌细胞排列整齐，整体未见病理性改变；模型组主动脉管壁结构破坏，有纤维斑块形成，内有大量的泡沫细胞形成，胶原纤维组织增多。实验组与模型组相比，主动脉内膜增厚，管壁不光滑，内皮细胞排列紊乱，但是未见纤维斑块的形成。见图1。

组 别nHcy/μmol·L-1TC/mmol·L-1TG/mmol·L-1LDL/mmol·L-1对照组2023．71±1．862．91±0．361．23±0．251．82±0．25模型组2042．69±3．64ab16．90±3．52ab2．94±1．12ab22．12±4．58ab实验组2027．55±2．365．64±1．751．59±0．233．68±2．37F值11．0414．6010．8812．93P值0．010．010．010．01

a 与对照组比较,P<0.05;b 与实验组比较,P<0.05

2.3 血管平滑肌细胞增殖的影响

在细胞生长第1天各组无显著性差异，在第2、3、4、5天对照组与瓜蒌皮提取物实验组血管平滑肌细胞(VSMC)生长速度无显著性差异，而Hcy模型组VSMC生长速度显著大于对照组和瓜蒌皮提取物实验组(P<0.05)。见图2。

图1大鼠主动脉病理组织切片

图2各组细胞生长速度的比较

2.4 血管平滑肌细胞中c- myc、c- fos基因mRNA的表达

对照组和瓜蒌皮提取物实验组c- myc和c- fos的表达无明显差异(P>0.05)，Hcy模型组c- myc和c- fos的表达显著高于正常组和实验组(P<0.01)。见表2。

组 别c⁃mycc⁃fos对照组0．145±0．00410．158±0．0037模型组0．253±0．0029ab0．372±0．0046ab实验组0．171±0．00190．160±0．0018F值9．7812．31P值0．00110．0009

a 与对照组比较,P<0.05;b 与实验组比较,P<0.05

2.5 血管平滑肌细胞中c- myc、c- fos蛋白表达

对照组和瓜蒌皮提取物实验组c- myc和c- fos的蛋白表达无明显差异(P>0.05)，Hcy模型组c- myc和c- fos的表达显著高于对照组和实验组(P<0.01)。见图3。

图3各组细胞中c-myc和c-fos蛋白表达

3 讨 论

动脉粥样硬化是各类心血管疾病的主要病因[6]。近几年由于人民生活水平的提高，各种心血管疾病的发病率在逐年提高，研究如何治疗动脉粥样硬化的问题迫在眉睫。导致动脉粥样硬化的病因较多，Hcy血症是独立危险因素之一。Mantjoro等研究发现男性血清中Hcy的浓度与心- 踝血管指数有显著相关性，血清中Hcy浓度升高可导致动脉血管壁增厚，弹性蛋白断裂，血压升高，最终导致心血管疾病的发生[7]。临床研究显示高Hcy尿症的患者易发生全身性的动脉粥样硬化和血栓，若体内Hcy的浓度进一步升高，患者死于心肌梗死和脑梗死的比例大大提升[8]，提示动脉粥样硬化的损伤程度与血清中Hcy的浓度有密切关系[9]。McCully等研究显示给小鼠喂养高Hcy饮食可导致小鼠全身大、中、小动脉发生动脉粥样硬化病变，最终引发小鼠各脏器(心、脑、脾、肺、肾等)的梗死[10]。本研究通过给大鼠喂养蛋氨酸饮食，成功诱导大鼠高Hcy血症。Olszewskia研究显示52 例40～60岁动脉粥样硬化的患者，其血清中Hcy水平与TG、TC浓度呈正相关[11]；动脉粥样硬化患者血清中Hcy的升高还伴有高水平的TG、TC、LDL以及低水平的高密度脂蛋白[12]，与本研究大鼠动脉粥样硬化模型组血清结果一致，主动脉组织病理切片进一步证实蛋氨酸饮食喂养诱导动脉粥样硬化模型成功。瓜蒌皮具有宽胸散结、清化热痰，用于治疗痰热咳嗽、心胸闷痛[13]。近几年研究表明瓜蒌皮提取物可抗炎症、抗氧化，抑制动脉粥样硬化的作用。本研究的结果证实瓜蒌皮提取物可以改善动脉粥样硬化大鼠的血脂水平及Hcy浓度，并且可以有效地减少动脉粥样硬化的斑块，说明瓜蒌皮提取物可有效治疗动脉粥样硬化。

动脉粥样硬化斑块形成的必要条件是血管平滑肌细胞过度增殖并向内膜移行[14]。平滑肌细胞是动脉中膜的主要成分，根据其功能不同分为收缩型和合成型两种表型，在正常生理状态下其处于非增生状态即收缩型，当内膜受损时可激活平滑肌细胞内相关信号转导系统，细胞由收缩型转变为合成型，开始迅速增殖生成泡沫细胞，最终形成动脉粥样硬化斑块[15]。本研究中当用Hcy处理大鼠血管平滑肌时，细胞增殖速度显著高于对照组，证实高浓度Hcy可刺激平滑肌细胞增殖，瓜蒌皮提取物可以抑制Hcy引起的细胞增殖。说明瓜蒌皮提取物抑制了动脉粥样硬化的必要步骤。瓜蒌皮如何抑制高Hcy引起的细胞增殖？之前研究证明，c- myc、c- fos等基因是动脉损伤之后的早期应答基因[16]。c- myc蛋白是获能因子，是DNA合成所必需的成分[17]；c- fos蛋白是一种反式调节蛋白。两种蛋白可进入细胞核内促进相关SMC基因开放，产生大量生长因子，促进SMC增殖[18]。 本研究证实，高Hcy可以促进平滑肌细胞c- myc、c- fos基因的表达，从而引起平滑肌细胞增殖。瓜蒌皮提取物可以抑制高Hcy引起的 c- myc、c- fos基因的表达增加，从而抑制其引起的细胞增殖。

综上所述，瓜蒌皮提取物可以抑制动脉粥样硬化的血脂水平，抑制高Hcy引起的血管平滑肌细胞的增殖，抑制动脉粥样硬化的发生发展，这为动脉粥样硬化的治疗药物筛选提供新的思路。

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