组蛋白去乙酰化酶11的表达在霍奇金淋巴瘤中的临床病理意义初探

黄仁宏，胡丽娜，王筱媛，曹婷，乔振东，闵志均，余明华，刘晓健

(复旦大学附属浦东医院 科研与创新中心，上海 201399)

经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin lymphoma，cHL)是起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤，其肿瘤细胞称为霍奇金- 李- 斯(Hodgkin- Reed- Steinberg, HRS)细胞。放化疗一直是治疗cHL的主要方法，虽然患者5年生存率超过85%，但25%左右的患者会复发或根本不会对治疗产生反应[1- 2]，免疫检测点抑制剂Nivolumab(Opdivo®)获FDA批准用于病情复发或进展的cHL患者[3]，提高了cHL患者客观缓解率，但完全缓解率不高，其毒副作用、耐药形成等现象仍需进一步研究克服。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitors，HDACIs)的开发和临床研究取得了很大进展[4]，HDACIs不仅诱导HRS细胞凋亡，还可以帮助重新激活微环境的细胞免疫功能[5]，给在免疫治疗的基础上进一步提高疗效、减少毒副作用带来了希望。

锌指依赖型HDAC共11种，为HDAC 1～11，对不同肿瘤如前列腺癌、胃癌、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤和乳腺癌细胞的研究显示，HDAC亚型的表达及其与各自临床病理特征及预后有相关性，但这些研究的结果不一致。瑞士研究人员研究了283例cHL中HDAC表达，发现cHL HDAC 1、2和3表达特征性增高[6]，HDAC1表达低与较差的预后相关；有研究人员对cHL组织标本进行HDAC 1～11的研究，结果显示22例中HDAC1、2、3、8和10阳性率为100%，仅对4例检测了HDAC11的表达，结果均为阴性，该研究没有涉及HDAC表达与预后的关系，考虑到目前没有针对HDAC11表达的较大样本的研究以及我国cHL和欧美患者存在流行病学和遗传学不同[7]，我们通过免疫组化检测HDAC11在cHL组织中的表达，并初步分析其与临床病理的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 56例cHL标本来自2002年8月至2010年3月复旦大学附属肿瘤医院病理科存档的石蜡包埋标本，病理分型特征见表1。所有患者入院治疗并签署知情同意书，有完整存档病历和随访资料,其中男30例，女26例，年龄9～77岁，中位年龄34.5岁，大于45岁22例，大肿块形成16例。56例均接受ABVD方案化疗，14例接受辅助放疗，此14例均为就诊时影像学判定为大肿块患者。

1.1.2 主要实验试剂 兔抗人HDAC11(Y- 25)多克隆抗体为美国Santa Cruz Biotechnology, Inc.产品(克隆号sc- 130776)，工作浓度为1∶100；二抗(抗兔Envision- AP)及DAB均购自丹麦DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 采用EnVision两步法,标本蜡块连续切片4 μm厚，73 ℃烤片20 min，62 ℃烤片2 h，脱蜡水化，置于EDTA抗原修复液加热煮沸修复15 min；3%H2O210 min封闭内源性过氧化氢酶，PBS洗3次，每次5 min；滴加一抗，37 ℃ 2 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃ 30 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB显色、苏木精复染，脱水干燥中性树脂封片。以TBS作空白对照，已知阳性切片作阳性对照。

表1HDAC11在反应性增生淋巴结和cHL中的表达

Tab1HDAC11proteinexpressioninreactiveproliferativelymphnodesandinthepatientswithcHLHodgkinlymphoma

组织来源和病理分型nHDAC11的表达程度/例阴性弱阳性阳性高表达率/%χ2值P值cHL5614281425．013．0040．014结节硬化型28616621．4混合细胞型22412627．2淋巴细胞消减型2002100富于淋巴细胞型44000

1.2.2 结果判断 由2名病理科专家独立阅读免疫组化切片和HE切片,明确病理类型和诊断,病理类型按WHO2008淋巴造血肿瘤分类法进行分类。以被观察细胞核有棕黄色或棕褐色颗粒染色为阳性细胞，采用双盲法随机选取10个高倍(400倍)视野,每个高倍视野下计数10个肿瘤细胞。观察阳性细胞所占的百分数及染色强度，对阳性细胞所占的百分数计分≤5%计0分、>5%～25%计1分、>25%～50%计2分、>50%～75%计3分、>75%计4分。细胞着色强度：不着色计0分、淡黄色计1分、棕黄色计2分、棕褐色计3分。累积0分为(-)，1～2分为(+)，3～4分为(++)，5～7分为(+++)。将0～2分定义为阴性，3～4分定义为弱阳性，5～7分定义为阳性(高表达)。

1.3 研究结果评价

参照美国国家癌症综合网(NCCN)评价标准，疗效评价分为完全缓解(CR)、未证实的CR(CRu)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)或复发、死亡。采用电话及门诊复诊的方式对患者进行随访。随访截止时间为2016年2月17日，平均随访时间为105.89(65～158)个月。无进展生存(PFS)时间定义为治疗结束至随访终点发生疾病进展等事件时间。总生存期(OS)时间定义为开始治疗至随访终点或任何原因死亡的时间。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，统计描述资料分析采用卡方检验或Fisher精确检验，生存分析采用Kaplan—Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HDAC11在cHL中的表达

cHL组织中HDAC11主要位于HRS细胞核，呈黄色或棕褐色颗粒状阳性反应(图1)。全组患者HDAC11的表达14例阴性、28例弱阳性和14例阳性，高表达率仅为25%。其中结节硬化型共28例，阴性6例、弱阳性16例和阳性6例，高表达率仅21.4%;混合细胞型共22例，阴性4例、弱阳性12例和阳性6例，高表达率仅为27.2%;淋巴细胞消减型2例均为阳性；富于淋巴细胞型4例均为阴性(表1)。HDAC11的表达在结节硬化型cHL和混合细胞型cHL之间无差异(P=0.21)，富于淋巴细胞型和淋巴细胞消减型由于病例数很少没有进行统计分析。周围反应性增生的淋巴细胞均为阳性。

2.2 HDAC11的表达与cHL临床病理特征的关系

统计学分析显示：HDAC11在cHL的组织HRS中的表达与是否有结外累犯有明显相关性(χ2=8.185,P=0.011)，而与性别、年龄、肿瘤分期、大肿块和B症状的关系不明显(表2)。

2.3 HDAC11的表达与预后的关系

56例cHL患者随访至2016年2月17日，12例死亡，其余44例均在随访中，平均随访时间为105.89(65～158)个月。全组中位PFS为140个月(95%CI为90.1～189.9)、OS为108个月(95%CI为96.0～119.9)。HDAC11阴性表达组的10 年 PFS大于HDAC11弱阳性组，也大于 HDAC11阳性组(分别为86%、70%和15%)，两两比较差异有统计学意义(Log- rank 检验P=0.013)；HDAC11阴性表达组的10 年OS大于 HDAC11弱阳性组，也大于HDAC11阳性组(分别为100%、78%和45%)，两两比较差异有统计学意义 (图2)。分析结果提示，HDAC11表达增高与cHL患者的PFS和OS呈负相关。

A.HDAC11在HRS细胞中表达阴性(箭头所示)；B.HDAC11在cHL HRS细胞中低表达(箭头所示)；C.HDAC11在cHL HRS细胞中高表达(箭头所示)

图1HDAC11在cHL组织中的表达SP×200

Fig1TheexpressionofHDAC11incHL(SP×200)

表2HDAC11的表达和cHL临床病理特征的关系

Tab2TherelationshipofHDAC11proteinexpressionwithclinicopathologicalfeatures

特征 nHDAC11的表达程度/例阴性弱阳性阳性高表达率/%χ2值P值性别 男268126230．8970．693 女30616826年龄 <45岁3410168230．9140．867 ≥45岁22412627分期 Ⅰ20612210 Ⅱ204106308．100．20 Ⅲ1224650 Ⅳ42200大肿块 是16664252．1270．324 否408221025B症状 有248106251．7640．390 无32618825结外受侵 有6402338．1850．011 无5010281224

图2HDAC11在HRS细胞中表达强度和经典霍奇金淋巴瘤预后的关系

Fig2TheexpressionofHDAC11andtheprognosisofpatientswithclassicalHodgkinlymphoma

3 讨 论

目前HDACs共有4类18种，Ⅰ类包括HDAC1、2、3和8，Ⅱ类为HDAC4、5、6、7、9和10，Ⅲ类为SIRT1～7以及Ⅳ类HDAC11，除Ⅲ类为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)依赖型，其他HDAC为锌指依赖型。HDAC1、2、3、8和11多在核内检测到，HDAC6多在胞浆内表达，而HDAC4、5、7、9和10常穿梭于胞浆和胞核之间[4]。在我国对不同肿瘤研究各种HDAC的表达有利于开拓新的研究领域、寻找到新的治疗靶点和促进选择性HDACI的进一步开发，这方面研究目前还不多，仅仅在实体瘤如前列腺癌、胃癌、结肠癌和乳腺癌的研究中有少量报道[8- 10]，而且HDAC的表达与临床病理特征及预后的关系各研究不尽一致[11]。

在皮肤T细胞性淋巴瘤检测到肿瘤细胞HDAC1高表达, HDAC2、HDAC6呈中等强度表达，HDAC1及HDAC2与临床预后无明显相关性，而HDAC6与预后有明显相关性；瑞士研究人员研究了283例cHL中的HDAC表达，发现cHL HDAC1、2和3表达特征性增高，HDAC1表达低与较差的预后相关[6]，这和我们前期研究结果相一致；有研究人员对cHL组织标本系统地进行HDAC1～11的研究，结果显示22例中HDAC 1、2、3、8和10阳性率为100%,4例中HDAC11均为阴性，但蛋白印迹研究提示HDAC11呈中等强度表达，该研究没有涉及HDAC表达与预后的关系[12]。有必要进行较大样本的HDAC11表达的研究，首先明确HDAC11在cHL中的表达特征，为进一步探讨HDAC11在cHL恶性表型维持的机制和研究新的选择性HDAC抑制剂打下基础。本研究通过免疫组化检测HDAC11在cHL组织中的表达，并分析其临床病理意义及其与预后可能存在的关系。我们的研究显示，HDAC11高表达率为25%，弱阳性为50%，阴性表达为25%，其表达与性别、年龄、肿瘤分期、大肿块及B症状的关系不明显，与是否有结外累犯有明显关联；HDAC11的表达在结节硬化型cHL和混合细胞型cHL之间无差异，富于淋巴细胞型和淋巴细胞消减型由于病例数很少没有进行统计分析。HDAC11表达高与PFS及OS相关，这和其他Ⅰ类HDAC对生存的影响是一致的。

对复发难治的cHL患者进行的Ⅱ期临床研究也说明选择性HDACI1、2、3和11抑制剂MGCD0103获得25%的客观有效率，中位PFS达到9个月，毒副作用相对轻微。目前还没有超选择性针对HDAC11的抑制剂，进一步研究HDAC11在cHL中的功能机制将是一个有价值的研究方向。最近研究显示，HDAC11在cHL中能调控OX40配体的表达，促进HRS细胞凋亡，同时用小RNA干扰技术沉默HDAC11可促进微环境中干扰素gamma的分泌，有助于打破HRS细胞对周围效应性CD4+T细胞的免疫耐受[13]，说明HDAC11的功能具有一定的复杂性。

我们的研究显示，测定HDAC 11对疾病的诊断及预后可能有一定的提示作用，有利于进行个体化治疗，值得进一步研究。和HDAC 1～3一样，HDAC11的表达场所为细胞核，其表达增高有助于DNA及组蛋白去乙酰化，不利于有关基因表达。从肿瘤治疗的角度，HDACIs有利于DNA复制、转录以及化疗药物发挥作用。ABVD是cHL标准一线诱导治疗方案，其中阿霉素可以和DNA结合，破坏DNA的转录复制所需的正常结构，研究表明加入HDACIs可大大提高阿霉素的疗效[14]。HDACIs和化疗的联合用药也是今后临床研究的热点之一，和HDAC1～3相比，HDAC11表达强度比较低，HDAC11高表达的患者更适合在化疗的基础上联合使用HDACIs的治疗。我们目前的研究病例数还比较少，需要扩大检测样本量，同时HDAC11的表达调控机制是我们进一步研究的课题之一。

cHL肿瘤组织微环境中HRS细胞数量很少，而周围反应性增生的淋巴细胞占绝大多数，形成cHL特殊的病理形态学特征，要做到精准杀灭肿瘤细胞而降低毒副作用需要研究HRS的HDAC表达特征, 才能进一步研究各种HDAC在cHL中的作用和其分子生物学机制，有利于进一步制定最佳的联合用药策略和高效地进行临床试验的设计，为根本解决霍奇金淋巴瘤的治疗问题奠定基础。

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