不同酵母和氮源对笃斯越橘果酒香气的影响

魏 铭，赵莱昱，杨航宇，吴玉文，李 腾，王绍阳，朱保庆，张柏林,*

（1.北京林业大学生物科学与技术学院，林业食品加工与安全北京市重点实验室，北京 100083；2.中国长城葡萄酒有限公司，河北 张家口 075400）

笃斯越橘（Vaccinium uliginosum L.），杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）植物，是生长在我国东北大兴安岭和长白山等地区的一种野生蓝莓[1]，其果实中含有丰富的营养物质，如花色苷、有机酸、维生素和微量元素等[2-4]，具有抗氧化、预防心脑血管疾病、抗肿瘤、保护视力等多种生理功能[5-8]。笃斯越橘具有含糖量低、含酸量高、不易贮藏等特点，多加工成果干、果酱或果酒等产品消费[9-10]。笃斯越橘果酒的风味主要依赖于酒中所含的糖、单宁和酸类物质，除此之外其本身及其在酿造过程中所呈现的特殊香气成分也是笃斯越橘果酒风味的主要组成部分。

香气成分是决定果酒风味、品质和典型性的重要因素[11-12]。笃斯越橘果酒的香气组成直接影响其感官品质，是构成高品质笃斯越橘果酒的一个重要指标。香气物质的种类、浓度及其和谐程度决定了笃斯越橘果酒的协调性、复杂性和典型性[13]。酵母代谢是产生果酒香气的途径之一，并与发酵基质中的氮源关系密切，氮源同时也是果酒中某些芳香物质的前体。目前对笃斯越橘香气成分的研究已有报道，但是比较不同酵母和不同氮源对笃斯越橘果酒香气影响的研究较少，且研究品种多集中于栽培蓝莓[14-16]，对笃斯越橘发酵酒香气的研究尚不多见。

顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用法是目前广泛用于食品检验、大气分析、生化和医学领域的高效检测技术，是酒类香气成分鉴定强有力的分析工具[17-18]。本实验以笃斯越橘为原料，分别选用酿酒酵母Red Fruit（以下简称为RF）和Vintage Red Challenge（以下简称为VRC），辅助添加无机氮源磷酸氢二铵（dibasic ammonium phosphate，DAP）和有机氮源NutriStart（以下简称为NS）进行发酵，采用顶空固相微萃取结合GC-MS联用技术，分析不同酵母和氮源种类对笃斯越橘发酵酒香气品质的影响，以期为笃斯越橘果酒的科学酿造提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 酵母与氮源

酵母和氮源商业酿酒干酵母RF和VRC 意大利Enartis公司；DAP 天津市凤船化学试剂科技有限公司；有机氮源酵母营养剂NS 法国Laffort公司。

1.1.2 酒样

发酵工艺参考文献[19]，以大兴安岭野生笃斯越橘为原料进行压榨，在压榨过程中在线添加SO2，使最终SO2的质量浓度为45 mg/L。调整果汁的糖质量浓度为240 g/L，酸度至pH 3.3；分别加入DAP（300 mg/L）或有机氮源酵母营养剂NS（450 mg/L），按0.2 g/L接入活化好的RF和VRC商业活性酿酒酵母。在室温条件下（17～23 ℃），采用5 L发酵罐进行发酵。在发酵过程中进行监控（测定温度和比重），当比重连续3 d不下降或还原糖的含量不在发生变化时，即可认为发酵终止。发酵结束后调整SO2的质量浓度至40 mg/L，满罐封存，用于理化指标和香气成分分析。

1.1.3 试剂

45 种香气物质标准品 美国Sigma公司；氢氧化钙、无水碳酸钠（均为分析纯） 北京化工厂；偏重亚硫酸钾（分析纯） 意大利Enartis公司。

1.2 仪器与设备

0.9-1.0、1.0-1.1比重计 上海逸川仪器仪表厂；FA 204电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；固相萃取柱 天津博纳艾杰尔科技有限公司；6890-5975型GC-MS联用仪、HP-INNOWax色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指标测定

依据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对乙醇体积分数、还原糖、总酚等理化指标进行测定。

1.3.2 样品预处理

顶空固相微萃取与GC-MS联用分析条件参照朱保庆等[20]的方法，稍作修改。取5 mL待测笃斯越橘果酒样品于15 mL的样品瓶中，加入1g NaCl，用带有聚四氟乙烯隔垫的瓶盖旋紧密封，于40 ℃条件下在磁力搅拌加热台上加热搅拌30 min，用已活化的固相微萃取头插入样品瓶顶空处，相同温度条件下加热吸附30 min。取下萃取头后立即在GC进样口于250 ℃条件下解吸8min。

GC-MS条件：采用6890-5975型GC-MS联用仪，HP-INNOWax色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气，流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；热解吸25 min。升温程序：40 ℃保持5 min，然后以3 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持2 min。质谱接口温度280 ℃；电子电离源；离子能量70 eV；质量扫描范围20～350 u。每个样品做2 次平行测定。

1.3.3 定性和定量方法

依据已有标准品的色谱保留时间和质谱信息以及NIST 08标准谱库比对结果，采用自动质谱解卷积和鉴定系统软件对化合物进行定性。对于已有标准品的物质，利用以混标法制备的标准曲线进行定量分析，对于没有标准品的香气物质，根据与其化学结构相似、碳原子数相近的标准品的标准曲线进行定量。

1.3.4 香气活性值计算

香气活性值是评价葡萄酒挥发性组分对实际香气贡献大小所普遍采用的一个指标，目前国内外已有许多研究应用该指标对果酒挥发性组分的香气贡献进行评价。每种挥发性组分的香气活性值为该物质的浓度与其嗅觉阈值的比值，本研究中各物质的嗅觉阈值和气味描述均参考文献[21]。

1.4 数据处理与统计

每个样品重复实验3 次，结果以 ±s表示；平均值、标准偏差和标准曲线等通过Microsoft Excel 2013软件进行分析；采用SPSS 22.0统计分析软件（SPSS Inc., Chicago,IL, USA）进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同条件发酵笃斯越橘果酒的发酵速率

图1 各组笃斯越橘果酒的发酵速率Fig. 1 Fermentation rate curves of bog bilberry wine

如图1所示，相对密度由比重计直接测定，当相对密度连续3 d不再改变时认为发酵终止。采用RF酵母发酵的2 组笃斯越橘果酒的发酵速度明显快于采用VRC酵母发酵的2 组笃斯越橘果酒；RF酵母发酵的2 组酒样发酵曲线较为相似，均在14 d左右发酵终止；VRC酵母发酵的2 组酒样中，采用DAP氮源的发酵速度稍快于采用NS氮源的酒样。

2.2 不同条件发酵笃斯越橘果酒的理化指标

表1 不同酵母和氮源发酵笃斯越橘果酒的理化指标Table 1 Characteristics of bog bilberry wines fermented with different yeast species and nitrogen sources

如表1所示，发酵酒的还原糖受氮源种类影响较大，使用无机氮源的2 种处理（RF＋DAP和VRC＋DAP）显著低于使用有机氮源的处理（RF＋NS和VRC＋NS）。与有机氮相比，无机氮容易被酵母利用，从而可以更大程度地增加酿酒酵母的活性，使发酵进行得更彻底[22]。2 种酵母（RF和VRC）对发酵酒还原糖含量影响不显著。相对应的，发酵时间和总酚含量受酵母种类影响比受氮源种类的影响大。RF酵母发酵速度快，14～15 d可以完成发酵（比重连续2 d不下降）；而使用VRC酵母时，接种后至发酵终止需22～24 d。VRC酵母发酵的酒样中酚类物质质量浓度为725～771 mg/L，显著少于RF酵母发酵的酒样（843～948 mg/L）。

2.3 不同条件发酵笃斯越橘果酒中香气成分GC-MS分析

表2 笃斯越橘果酒中香气物质组成Table 2 Aroma composition of bog bilberry wine

续表2

4 种处理条件下发酵的笃斯越橘果酒香气成分的鉴定结果见表2，GC-MS总离子流色谱图见图2。在所有酒样中共鉴定出86 种香气成分，酯类化合物最多，有32 种，其次为醇类18 种，萜烯类13 种，酸类10 种，醛酮类7 种，以及其他类6 种，检测结果与文献[13,23]报道一致。4 种酒样含量最多的香气成分均为异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯以及乙偶姻，质量浓度分别为490～753、253～349、90～153 mg/L以及89～178 mg/L。酯类物质阈值低，对果酒主体香气贡献最为显著，对笃斯越橘果酒的香气影响最大；醇类、酸类物质阈值较高，对香气成分影响有限。

图2 各组笃斯越橘果酒香气成分的GC-MS总离子流色谱图Fig. 2 GC-MS chromatogram of bog bilberry wine

在RF酵母和DAP氮源发酵的酒中共鉴定出86 种香气成分，其中大于阈值的有20 种；在RF酵母和NS氮源发酵的酒中共鉴定出80 种香气成分，其中大于阈值的有18 种；在VRC酵母和DAP氮源发酵的酒中共鉴定出79 种香气成分，其中大于阈值的有17 种；在VRC酵母和NS氮源发酵的酒中共鉴定出79 种香气成分，其中大于阈值的有18 种。有研究表明，不同的酵母种类会在发酵过程中影响到高级醇及酯类的含量和比例，从而导致果酒最终出现香气特征差异[24]。无机氮源含有的营养成分比有机氮单一很多，但有机氮源的使用并没有使香气增加，可能是由于无机氮源更容易被酵母利用。从发酵速率也可以看出（图1），添加无机氮源的酒样，发酵速率比添加有机氮源快。研究表明，添加有机氮源的酒样，高级醇含量过高，从而会影响酒的品质；本实验中，只有VRC酵母发酵的酒样，添加有机氮源产生的高级醇相对较多。此外，无机氮源被证实可使酒样中丁酸乙酯含量升高，这与本实验研究结果一致[25]。

2.4 不同条件下发酵笃斯越橘果酒的主要香气成分比较

2.4.1 醇类组分的比较

醇类化合物是酒中主要的香气物质，总含量最高。4 种酒样共检测出醇类物质18 种，共有14 种。其中含量最高的物质为异戊醇和异丁醇，质量浓度分别达到490～753 mg/L和253～349 mg/L，与前人研究一致，盖禹含[15]和严红光[16]等研究均表明3-甲基-1-丁醇（即异戊醇）是笃斯越橘果酒含量最高的香气物质，异戊醇具有青草和植物香气。此外，检测结果表明，1-丁醇、1-癸醇以及十二醇为RF酵母和DAP发酵的笃斯越橘果酒所特有，在其他3 种酒中均未检出。

2.4.2 酯类组分的比较

发酵过程酒样中的高级醇来源于氨基酸的降解，其浓度直接影响果酒香气[19]。4 种酒共检测出32 种酯类化合物，共有31 种，其中质量浓度最高的物质为乙酸乙酯，为90～153 mg/L，乙酸乙酯能赋予笃斯越橘果酒柔和的果香和奶油味[26]；其他对香气有显著贡献的酯类化合物还有乙酸异戊酯、辛酸乙酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯等，这些化合物通常具有花香或果香味，如乙酸异戊酯具有强烈果香，似香蕉、梨的酸甜味[10]。可以看出，由于采用相同的原料发酵，不同酒中的酯类化合物种类和含量表现出了较高的相似性。

2.4.3 酸类组分的比较

酸类是笃斯越橘果酒中重要的协调成分，不仅影响酒的感官品质，而且对花色苷等物质具有保护作用[27]。4 种酒共检测出酸类物质10 种，香气活性值大于1的香气化合物共有4 种，分别是己酸、辛酸、癸酸以及9-癸烯酸，其中癸酸的含量仅在RF酵母发酵的2 种酒中超过了阈值，类似地，采用RF酵母发酵的酒中其他酸类物质的含量大多也高于采用VRC酵母发酵的酒。

2.4.4 萜烯类和降异戊二烯类组分的比较

萜烯是酒中重要的呈香物质，果酒中的萜烯主要来源于果实，随着酿造和陈酿过程的进行，果实中的糖苷结合态萜类会通过酶解或酸解作用形成游离态的萜类芳香成分，从而增强果酒的风味[28]。4 种酒共检测出萜烯类化合物13 种，有12 种为4 种酒所共有，蛇麻烯仅在RF酵母发酵的2 种酒中检出。萜烯类物质的含量虽然不高，但由于某些萜烯的阈值很低，所以对酒的香气也有着十分重要的影响。在检测到的萜烯化合物中香气活性值最大的化合物是β-大马士酮，它带有玫瑰花香和异域香气[13]，在所有萜烯类化合物中对香气的贡献最为显著，其他萜烯类物质的含量均未超过阈值。

2.4.5 醛酮类组分的比较

果酒发酵过程中，不饱和脂肪酸能够在脂氧合酶的作用下，代谢产生醛和酮[29]。4 种酒中共检测到7 种醛酮类化合物，含量均较少，大多以痕量存在，只有癸醛含量超过了阈值，另外，在RF酵母和NS氮源发酵的酒中检测到少量芸香酮，其他3 种酒样中未检出这2 种物质。

2.4.6 其他组分的比较

在笃斯越橘果酒中还检测到2-乙酰基呋喃、γ-丁内酯、乙偶姻、伞花烃、3-甲硫基丙醇以及萘。除乙偶姻以外的其他化合物的含量均较少，在酒中痕量存在或含量远低于阈值；乙偶姻可产生令人愉快的奶油香气[30]，在酒中质量浓度达到89～178 mg/L，在RF酵母和DAP作为氮源发酵的酒与VRC酵母和NS氮源发酵的酒中乙偶姻的含量超过了阈值。

2.5 香气轮廓图

图3 不同酵母和氮源发酵的笃斯越橘果酒香气轮廓图Fig. 3 Aroma profiles of bog bilberry wines fermented with different yeast species and nitrogen sources

食品中的香气成分含量并不能完全反映其对整体香气贡献的大小，需结合香气阈值考虑呈香组分的香气活性值[31]。为了更好地体现香气类型与组间差异，对各组分笃斯越橘果酒的香气活性值取以10为底数的对数值，绘制香气轮廓图，如图3所示。香气活性值为香气化合物的含量与感官阈值的比值，数值越大表示该香气越突出。4 种处理生产的笃斯越橘果酒香气轮廓较为相似：果香最浓，随后是脂香和甜香，花香、化学味和青草香较弱。虽然能检测到个别呈现坚果、焦糖和烘烤风味的化合物，但均未达到阈值。4 种酒样相比，RF＋DAP处理的酒样香气最为浓郁，果香、脂香和甜香的香气活性值均远高于其他3 种处理的酒样，这表明RF酵母产生香气的能力明显高于VRC，此外，与有机氮源（NS）相比，无机氮源（DAP）成分单一，质量较稳定，可被酵母快速利用，产生香气成分的种类和含量增多[21]。

3 结 论

本实验分析了不同酵母和氮源处理条件下发酵笃斯越橘果酒香气成分的变化，采用RF酵母和DAP作为氮源的果酒发酵速度更快，发酵的残糖量更少，表现出了一定的发酵优势。香气分析表明，尽管4 种处理条件下的果酒香气化合物表现出一定的相似性，但仍存在种类和含量上的显著区别，采用RF酵母和DAP氮源的酒样香气化合物种类最多，总量也高于其他处理果酒酒样，该研究为提升笃斯越橘酿造果酒的品质提供了理论依据。

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